Taq Talk第23&23期 | 如何优化多重qPCR实验及如何选择单重或多重反应

2023-02-06 10:14:59 赛默飞世尔科技生命科学产品

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在上一期Taq Talk中，我们了解了SYBR Green检测的优化方法。在本周第二十二和二十三期课程中，我们来学习如何优化多重qPCR实验及如何选择单重或多重反应。

什么是多重反应

PCR多重反应是指在同一个反应中实现两个或更多基因序列的扩增和特异性检测。要获得成功，PCR多重反应必须能够生成针对目的序列的足够的扩增产物。多重实时荧光定量PCR可同时产生定性和定量的结果。对于定量多重PCR，所有的目的序列的扩增必须能产生足够的几何期即对数期的信号。对于定性结果，如果扩增产物足够，也可利用终点检测方法 (如凝胶电泳) 检测所有目的序列。

实时荧光定量PCR多重反应可用于生成定性或定量结果。要完成实时荧光定量PCR多重反应，所有目的序列都必须生成足够的几何相信号。

多重反应的优点

多重反应的三个优点：

更高的通量 (每块反应板可分析更多样本)、更低的样本用量和试剂用量——取决于实验中的靶点数。例如，如果定量实验中只包括一个靶点分析，在同一反应中加入标准品分析，如内参，进行双重反应靶点分析将提高2倍的通量，同时每个样本减少一半的样本用量和试剂用量。但如果定量实验包括两个靶点分析，可将两个靶点反应与一个标准品反应组合成三重反应。在这种情况下，样本用量和试剂用量将进一步降低。

如果同时进行靶点和标准品多重反应，则多重反应还具有另一个优点——使加样精度错误最小化。同一孔的靶点和标准品数据来源于一次加样，因此任何加样精度错误应对靶点和标准品结果具有同等影响。为获得精度优势，必须采用同一孔的标准品数据对靶点数据进行标准化，然后计算技术重复的精度。比较利用单重反应方式分析的数据 (未经过基于孔的标准化) 与利用多重反应方式完成的分析，证明多重反应的精度优势较大，具体取决于单重反应的错误。例如，对于单重反应精度错误极少的样本，多重反应的精度优势也微乎其微。

对于需要更高精度的定量实验，多重反应的精度优势显得尤为重要。例如，在拷贝数变异实验中，区分1拷贝基因与2拷贝基因是2倍差异，需要良好的精度。但区分2拷贝基因与3拷贝基因仅为1.5的差异，这需要更高的精度。对于此类型的实验，推荐采用多重反应方法，其有助于达到该实验所需的精度。

多重反应的染料选择

假定采用的是多染料实时荧光定量PCR荧光试剂，则多重反应中各种基因序列的检测将需要不同的报告基团染料。同一孔内的报告基团染料必须被实时荧光定量PCR仪充分激发并准确检测。仪器生产商应能够提供推荐染料。请注意，Applied Biosystems^®实时荧光定量PCR预混液中包含一种红色的参比荧光染料。仅带有蓝色激发光的仪器可充分激发基于ROX^™染料的参比荧光染料，但蓝色激发光一般不足以激发用作报告基团的红色染料。

无需根据靶基因或基因产物的类型指定报告基团染料，但遵循染料的指定模式可简化多重分析的构建。例如，FAM^™染料是TaqMan^®探针中最常用的报告基团染料。我们遵循其模式指定FAM^™染料作为靶点分析的报告基团染料，并指定VIC^®染料作为标准品分析的报告基团染料。采用此模式，可通过将不同的 FAM^™染料标记的靶点分析与相同的标准品分析VIC^®染料进行配对，构建多个双链分析。进行三重分析时，可将第三种染料ABY^®或JUN^®染料与FAM^™染料和VIC^®染料相结合。请注意，如使用ABY^®染料，则在同一孔内不应有TAMRA^™染料存在，如果使用JUN^®染料，MUSTANG PURPLE^®应该作为参考标准取代ROX^™染料。