Taq Talk第八期 | 如何评价检测中的PCR效率

在上一期Taq Talk中，我们学习了如何为TaqMan SNP检测选择序列。在本周第八期的课程中，我们来了解如何评价检测中的PCR效率。

反应效率对实时荧光定量 PCR 数据的准确度极为重要。在理想状态下，每个循环后，PCR 反应中的每个靶点拷贝将被复制，全长靶分子数目倍增：这对应100%扩增效率。随着热循环过程的进行，效率的差异将被放大。因此，100%效率的任何偏差均可导致潜在的错误数据。

扩增反应对数期的斜率可用于检测反应效率。要获得准确且可重复的结果，反应效率应尽可能接近100%，相当于斜率为-3.32。效率100%的PCR效率对应的斜率为-3.32，可根据下列公式确定：

效率 = 10^(-1/斜率)-1

实时荧光定量 PCR 数据的标准曲线示例。标准曲线的 y 轴表示阈值循环 (Ct)，x 轴表示起始 RNA 或 DNA 靶点量。斜率、y-截距和相关系数值可用于提供反应性能相关的信息。

理论上，PCR 反应的效率 (E) 应为100%，表示在指数扩增阶段每次热循环后模板倍增。实际效率可提供反应相关的重要信息。扩增片段的长度、二级结构和GC含量等实验因素会影响效率。影响效率的其它因素包括反应本身的动态范围、使用的试剂浓度未达到最佳以及酶的质量等，这些因素均会导致效率低于90%。一种或多种试剂中存在PCR抑制剂可使反应效率超过110%。良好的反应效率应在90%至110%之间，其对应的斜率为-3.58至-3.10。

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