Taq Talk第四期 | TaqMan检测的工作原理

在上一期Taq Talk课程中，我们学习了实时PCR中最常提及、最重要的中间数据：Ct值。在本周第四期的课程中，我们一起来探讨TaqMan^®检测的工作原理。

TaqMan^®检测作为荧光定量PCR金标准长久以来被广泛应用。与染料法实时PCR不同，TaqMan^®检测中会增加荧光探针成分，探针通过荧光共振能量转移（FRET）发生作用。

我们通过两种荧光染料对 FRET 进行图示说明：绿色和红色（图1）。绿色荧光染料的发射光能量较红色荧光染料更高，这是由于绿光的波长比红光短。如果红色染料邻近绿色染料，则激发绿色染料将导致绿光的发射能量被转移至红色染料上。换言之，能量从高处转移至低处。继而绿色染料的信号将被抑制或“猝灭”。但如果两种染料相距较远，则不会出现 FRET 现象，绿色染料能发射出全部信号。用于靶点检测或定量的 5’ 核酸酶 Assay 通常包括两个PCR 引物和一个 TaqMan^® 探针 (图 2)。

在 PCR 开始之前，TaqMan^® 探针完整且具有一定的灵活性。探针完整时，报告基团和淬灭剂之间具有天然的亲和力，可促进 FRET 的发生 (图3)。在 PCR 开始之前，报告基团信号被淬灭。

在 PCR 过程中，引物和探针与靶点退火结合。DNA 聚合酶延伸探针上游的引物。如果探针与正确的靶序列结合，则聚合酶的 5’ 核酸酶活性会切断探针，释放出含有报告基团染料的片段。剪切完成后，报告基团和淬灭染料不再相互吸引；释放的报告基团分子将不再被淬灭。

基于TaqMan^®探针法的qPCR检测可提供比染料法更好的灵敏度和特异性。点击观看视频，跟Byron一起学习TaqMan^®检测的工作原理。