Taq Talk第12&13期 | qPCR基线和阈值的概念及设置方法

在上一期Taq Talk中，我们学习了哪种淬灭基团最适合实时PCR中的TaqMan探针，在本周第十二、十三期课程中，我们来了解qPCR基线和阈值的概念及设置方法。

实时荧光定量 PCR 反应的基线是指在 PCR 的最初几个循环中 (一般为第3至15个循环) 的信号水平，此阶段的荧光信号变化极小。低水平的基线信号相当于反应的背景或“噪音” (图1)。每个实时荧光定量 PCR 反应的基线应通过用户分析或扩增曲线自动分析，根据经验确定。应仔细设置基线，以准确确定阈值循环 (Ct) 。基线确定应考虑足够的循环数，消除扩增早期的背景，但应排除扩增信号开始超过背景的循环。当比较不同的实时荧光定量 PCR 反应或实验时，应采用同样的方法确定基线。

阈值 (超过背景值的荧光强度，用来确定 Ct) 是另一个由软件自动设置的参数，但也可手动调整。设置阈值可将相关扩增信号从背景中区分出来。实时荧光定量 PCR 仪软件通常将阈值自动设置为基线荧光值标准差的10倍。但阈值可设置在 PCR 指数期的任意点。

扩增曲线基线线性度是影响结果的参数之一。基线范围设置常被忽略，但它也可对反应效率产生影响。仪器软件通常能够在曲线的平滑部分自动设置基线。但当 Ct 值出现过早时，其设置的基线错误地包括了非平直区域。图2显示了同一曲线的不同基线设置。图2A显示的曲线的基线范围包括第1至第14个循环，由于在第10个循环中即可检测出荧光，因此基线设置范围过宽。其结果是造成曲线下降和 Ct 延迟。基线被重新设置在第2至第8个循环的线性范围内，使曲线和 Ct 回到准确的位置上。

Applied Biosystems™提供两种阈值设置方法：自动和手动。自动设置中，软件将自动选择阈值，此阈值更适合平台更高的曲线 (图3中的蓝色曲线)。然而这将导致此数据组中的红色曲线的 Ct 值出现偏差，因为其最佳阈值比此值更低。通常情况下，默认设置通常已十分适当，但也可将阈值手动拖至指数期中间，以获得更高的准确度。因此，需对每个数据组进行独立研究，这样才能根据具体情形选择最佳阈值。

Applied Biosystems™作为qPCR品牌领导者，为基础科研和转化研究提供完整解决方案，通过优质的产品和优化的流程协同增效，助力研究者获得准确、可重复的结果。

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