Taq Talk第十七期 | 实时PCR绝对定量

2023-02-06 10:20:05, ABI 赛默飞世尔科技生命科学产品

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在上一期Taq Talk课程中，我们了解了获取高质量、可重复qPCR数据的王牌小贴士。在本周第十七期课程中，我们来学习实时PCR中的绝对定量。

绝对定量是指在实时荧光定量 PCR 实验中，对已知量的样本进行连续稀释后扩增，生成标准曲线。然后通过与此曲线比较，定量未知样本。绝对定量可测定靶点的实际拷贝数，常用于确定病毒滴度。

标准曲线生成

采用绝对标准曲线，目的靶点的拷贝数必须已知。这表示在生成曲线前，应准确定量模板。图1重点显示了标准曲线设置。目的靶点样本被准确测定为含有 2 x 10¹¹个拷贝。将样本连续八次稀释 10 倍至 2 x 10³个拷贝，对每个稀释样本进行实时荧光定量 PCR，重复至少三次。生成的标准曲线与每个特定的 Ct 的拷贝数相关。然后通过与该标准曲线进行比较，推算出未知样本的拷贝数。定量的准确度与标准曲线的质量直接相关。

在绝对定量时，应考虑：

1 用于生成标准曲线的模板及定量该模板采用的方法是实验的基础。连续稀释时的加样准确度极为重要。还应记住实时荧光定量 PCR 的灵敏度会放大微小的人为误差。

2 目标模板和连续稀释的实际样本的 RT 和 PCR 效率相当至关重要。

图1.绝对定量标准曲线设置流程

标准品选择

如前所述，生成绝对标准曲线采用的模板将决定数据的准确度。尽管您可能需要均匀的纯模板进行初始拷贝数测定和标准曲线生成，但最好使用与实验样本尽可能类似的目标模板。由于诸如核酸提取和逆转录等步骤可影响反应的动态范围，所以应采用与实验样本尽可能相同的处理步骤。

下列类型的模板可用作绝对定量标准品：

DNA 标准品

目的靶点的 PCR 扩增片段或含有目的靶点的质粒克隆。

优点

易于生成、定量，可在适当的储存条件下维持稳定性。

缺点

无法进行 qRT-PCR 的逆转录步骤，大大影响了反应效率。

RNA 标准品

目的靶点的体外转录 RNA。

优点

结合了 RT 效率，最大程度地模拟了目的靶点。

缺点

需要耗费时间生成该标准品，因其不稳定，难以保持长期准确度。

RNA 和 DNA 标准品的均质性意味着它们通常具有较实验样本更高的效率。因此可将背景 RNA (如酵母 tRNA) 插入标准模板中，形成更具异质性的环境，有助于平衡反应效率。背景 RNA 可抑制 cDNA 合成率达10倍。

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绝对定量是适合需要测定靶点实际拷贝数的研究人员采用的实时荧光定量 PCR 分析方法，同时也是最费力、最复杂的定量形式。此方法要求周密的计划和高度准确的标准曲线。是否有更简单的方法开展绝对定量？当然有！

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