Taq Talk第九期 | 什么是适合您的 qPCR 实验的逆转录方法

2023-02-06 10:25:11, ABI 赛默飞世尔科技生命科学产品

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在上一期Taq Talk中，我们学习了如何评价检测中的PCR效率，在本周第九期的课程中，我们来了解逆转录qPCR方法的选择。

逆转录qPCR方法的选择

在进行针对RNA靶标的基因分析研究时，我们可从便捷性、灵敏度和Assay设计几个方面选择一步法或两步法qRT-PCR。需要针对不同检测评估两种技术的优点和缺点：

一步法qRT-PCR

在一步法qRT-PCR中，同一支反应管内可完成第一链cDNA合成反应和实时荧光定量PCR反应，简化了反应设置，并降低了污染的可能性。在一步法逆转录过程中同时存在逆转录酶和热稳定性DNA聚合酶，RT在高温DNA聚合酶活化阶段被灭活 (所谓的热启动)。采用这种单管操作，在PCR阶段可以对生成的所有cDNA进行扩增。

一步法qRT-PCR的优点包括：

防止污染：闭管系统可防止在RT和PCR阶段引入污染物
便捷：移液步骤减少，最大程度缩短操作时间，非常适合高通量样本筛选
灵敏度：由于生成的所有第一链cDNA均被用于实时荧光定量PCR扩增，因此一步法反应的灵敏度高于两步法反应

一步法qRT-PCR的缺点包括：

形成引物二聚体的风险更高：一步法反应中存在的正向和反向基因特异性引物，极易在42–50°C逆转录条件下形成二聚体。对于采用DNA结合染料进行检测的反应，这个问题尤为严重
cDNA不适用于其它实时荧光定量PCR反应：一步法反应采用了RT步骤的所有cDNA，因此如果反应失败，则样本丢失

两步法qRT-PCR

在两步法qRT-PCR中，第一步是采用逆转录酶(RT)将总RNA或poly(A) RNA逆转录为cDNA。此步骤利用随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物 (GSP)完成第一链cDNA合成反应。逆转录完成后，将约10%的cDNA转移至单独的管中，完成第二步实时荧光定量PCR反应。

两步法qRT-PCR 的优点包括：

cDNA可以保存并用于其它实时荧光定量PCR反应：两步法qRT-PCR生成了足量的cDNA，可用于多个实时荧光定量PCR反应，适用于珍贵或有限的样本
多靶点：根据使用的RT引物，您可以从单个RNA样本中筛查多个靶点

两步法qRT-PCR的缺点包括：

便捷性较差：两步法反应需要更多操作，不适用于高通量应用
污染风险：由于每步使用单独的试管，因此增加了污染的风险

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