Cell Stem Cell. | 疤痕的克星！单细胞转录+蛋白组研究伤口再生的多组学图谱

2022-06-29 07:49:40, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

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前言

纤维化即用无功能结缔组织替代有功能的组织，是几乎所有人体器官损伤的最终结果。疤痕是真皮损伤后的纤维化，是一种优先考虑愈合速度的晚期进化适应。

2022年2月，斯坦福大学Shamik Mascharak等课题组联合在Cell Stem Cell.期刊发表的题为“Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing”（IF:24.633）的研究成果，通过单细胞转录组学、蛋白质组学研究方法，发现通过激活Trps1和Wnt信号，破坏YAP机械转导可通过成纤维细胞产生再生修复，Trps1作为一个关键的调控基因，对伤口再生是必要的和部分充分的。

研究背景

疤痕缺乏皮肤毛发或腺体，因此，没有正常的体温调节或屏障功能。尽管纤维化带来了巨大的医疗负担，但由于对再生与纤维化愈合的基本机制的理解有限，目前依然缺乏针对性的治疗方案。

研究思路

研究结果

1.纤维化和再生伤口的多模式分析

由于损伤修复包括多个阶段，检测治愈过程中细胞和分子的动力学就显得至关重要了。分析了七个时间点的小鼠伤口和皮肤：UW（未受伤）皮肤、术后2天(POD2，炎症)、POD7(成纤维细胞增殖)、POD10、POD14(伤口重新上皮化，成纤维细胞产生ECM)、POD21和POD30(成纤维细胞重构ECM)。伤后立即在伤床上注射维替泊芬或对照(磷酸盐缓冲盐水[PBS])。

对照创面形成明显的纤维性疤痕，大体为裸露区域，有致密、线性排列的ECM纤维，无次级成分；相反，POD30时，经维替泊芬处理的伤口再生的毛囊（HF）和腺体水平与UW皮肤相似，且ECM纤维密度更低，方向更随机。每只小鼠三分之一的组织用于组织学研究，其余的按建立的荧光激活细胞分选(FACS)策略进行细胞分选，以分离成纤维细胞(Lin−)和其他细胞(主要是免疫细胞;Lin+)。一半细胞用于蛋白组学分析，其余的用于scRNA-seq分析；每个样本都用HTO标记，使scRNA-seq分析的细胞和同一只老鼠的蛋白组学以及组化样本相联系。

成纤维细胞在维替泊芬治疗的伤口中轻度增加；然而，对照组和维替泊芬创面的细胞比例大致相似。在主成分分析中，Lin-和Lin+蛋白质组样本在时间点上存在显著差异，而PBS和维替泊芬样本之间则无明显差异。GSEA发现PBS伤口成纤维细胞在机械激活方面富集，维替泊芬样本的伤口成纤维细胞在蛋白和代谢过程富集。

使用一种新开发的图像处理算法对受伤和UW皮肤的ECM超微结构进行了量化，确定了每个样本中结缔组织切片的294个参数，并通过t分布随机邻域嵌入进行聚类分析。随着时间的推移，对照创面ECM与UW的ECM显著区分，显示纤维化瘢痕。相反，POD14/30维替泊芬创面与UW皮肤重叠，表明维替泊芬治疗后愈合产生UW样ECM。在这两种处理中，POD7-14之间的差异最大，这与ECM沉积主要发生在这段时间相一致。

图1 | 瘢痕和再生伤口修复的多模式研究

2.识别修复的分子轨迹

成纤维细胞对机械力高度敏感，是瘢痕形成的主要驱动因素，因此假设维替泊芬通过改变成纤维细胞表型促进再生，并将scRNA-seq分析集中在成纤维细胞上。通过Monocle3来生成细胞轨迹，选择一个最优簇来最大限度地捕捉PODs之间的变化。由此产生的轨迹有两个分支，早期(POD2)成纤维细胞在分支点附近，晚期成纤维细胞在分支末端。UW皮肤成纤维细胞几乎全部位于分支末端，该分支也富含维替波芬伤口成纤维细胞。因此，可以推测分支末端一个再生修复轨迹，成纤维细胞向UW样状态发展，而分支附近是一个相对的纤维化轨迹。

图2 | 假时间内成纤维细胞转录组轨迹分析

Seurat聚类识别了6个成纤维细胞聚类：聚类0和4组成了再生部分；1、2、5构成纤维性部分；3主要由UW皮肤成纤维细胞组成。通过计算感兴趣轨迹上基因的相关性，纤维性部分富含促纤维化标志物，如Dpp4、Fap和Gpx3。GSEA中和假定时间正相关性位于前1%的基因集中于ECM聚集，生长因子、转导和纤维化相关条目。

图3 | 成纤维细胞瘢痕形成和再生过程中的假时间和CytoTRACE分析

和假定时间呈强负相关性的基因包括很多发展和再生相关的基因，同时还发现了几个参与Wnt信号转导的基因，包括Wnt靶点Axin2和Twist1；Wnt兴奋剂Rspo1等。GSEA分析与假定时间负相关相关的前1%基因，再生部分富集了骨形态发生蛋白(BMP)和Wnt相关条目。

接下来，使用SCENIC平台来比较基于基因调控网络的轨迹。Trps1、Gli1和Twist1调控蛋白在再生部分中被更多激活，进一步支持Wnt的激活。使用CellChat分析scRNA-seq数据，发现在再生部分中涉及瘢痕成纤维细胞和非典型Wnt信号的促炎信号增加。

图4 | 分析成纤维细胞相互作用

通过RNA速率分析，发现纤维部分和再生部分的RNA速度方向相反，纤维部分指向增加的PODs，而再生部分指向更早的时间点细胞。应用CytoTRACE，UW皮肤成纤维细胞分化程度最高，而伤口成纤维细胞分化程度相对较低。随着POD的增加，纤维部分成纤维细胞总体分化程度较低，分化程度增加，而再生细胞沿轨迹分化程度降低，表明随着愈合过程的进展，发育潜力增加。

接下来分别分析了组成每个轨迹的簇，并检查了每个分支上与CytoTRACE评分最相关的基因。纤维性部分评分随时间的下降主要是由ECM相关基因驱动的，与分化成成熟瘢痕成纤维细胞一致。

3.伤口纤维化和再生轨迹标记的研究

通过免疫荧光技术发现，与维替泊芬创面相比，PBS中Dpp4+细胞显著增加，特别是在真皮深层。与维替波芬抑制机械诱导一致，YAP在PBS创面中表达高于维替波芬创面或UW皮肤。Trps1在对照创面中表达很低，但在维替泊芬创面中却很高。基于人工神经网络对数千个细胞Trps1核定位的定量分析显示，在维替泊芬创面中，核Trps1+成纤维细胞数量较高。尽管如此，UW皮肤Trps1的表达仅限于基底上皮和真皮乳头，但在再生HF周围的维蒂波芬创面中发现了大量核Trps1+细胞簇。

PBS和维替泊芬治疗伤口的一个显著区别是后者在30天内出现再生HF，而前者形成裸露区域。Trps1，在HF发育中起关键作用，是最重要的候选因子。多项研究表明，Trps1与HF的形态发生有关，而异常的Trps1活性与人类毛发过度生长的条件有关，这些研究使Trps1成为一种很有前途的推动伤口HF再生的候选因子。支持这一假设的是，Trps1+细胞在再生伤口中富集，并在空间上聚集在新发性HF周围。鉴于再生轨迹的特点是机械转导减少和Trps1升高，我们推测Trps1可能是伤口再生的关键调控因子。

基于多模式分析，研究者选择4个标记来区分和代表纤维化和再生之间的通路：Ankrd1，Trps1，Rspo1和Dpp4。为了探测关键基因的空间分布，研究者上述4种标记进行了多重RNAscope原位杂交；为了聚焦于真皮成纤维细胞，进行了真皮受限的形态学重建。在POD 14维替波芬创面中，在真皮浅表层中发现含有Rspo1和Trps1 RNA颗粒的成纤维细胞聚集在内陷上皮周围，与新发HF一致。

相反，在POD14 PBS创面中，Rspo1+和Trps1+细胞随机分布于真皮。在POD 30，纤维化/再生创面之间表型分化最大的时候，PBS创面成纤维细胞有更多的Dpp4和Ankrd1，而维蒂泊芬创面有更多的Rspo1和Trps1 RNA颗粒，集中在再生HF周围。

图5 | 瘢痕形成和再生过程中成纤维细胞的空间转录组分析

4.确定Trps1在再生中的功能意义

为了确定Trps1在伤口再生中的作用，研究者首先进行了成纤维细胞特异性Trps1 OE，以评估在正常瘢痕条件下，Trps1是否足以用于伤口再生。为了证实特异性，非成纤维细胞标志物的IF染色显示GFP信号仅存在于成纤维细胞中，而不在内皮细胞、脂肪细胞、上皮细胞或免疫细胞中。

通过在早期(POD3和7)和晚期(POD7和17)中过表达Trps1，Trps1-OEC创面形成瘢痕，而Trps1-OEE和Trps1-OEL创面瘢痕不明显，HF再生较少。组织学证实Trps1表达增加，并显示在Trps1-OEE和Trps1-OEL伤口中有少量再生附属结构和更多的UW样ECM。这些发现从定量上证实HF/腺体明显增加，ECM评分显著更高。与Trps1-OEE相比，Trps1-OEL伤口的再生更为显著，这表明Trps1的促再生作用可能在早期愈合时是最显著的。

为了评估Trps1对维替波芬诱导的伤口再生是否必要，开发了FLEXon EGFP: miR30-mTrps1慢病毒载体，敲除早期(POD−3/7;Trps1-KDE)和晚期(POD 7/17;Trps1-KDL)的Trps1。对照注射FLEXon EGFP:Scramble miR30慢病毒。POD 30时收集伤口。Trps1-KDC创面表现为毛发再生和无瘢痕，而Trps1-KDE和Trps1-KDL创面形成无毛疤痕。Trps1-KDE和Trps1-KDL损伤完全破坏ECM再生，取而代之的是疤痕ECM。

有趣的是，仅在Trps1- KDL伤口中观察到附属结构的显著损失，这意味着在愈合后期，为维蒂波芬诱导的附属再生，Trps1是明确需要的。综上所述，这些数据表明，Trps1对于完全的伤口再生是必要的，在早期和晚期愈合中具有独特的作用。

图6 | 成纤维细胞靶向慢病毒Trps1过表达和敲除

研究讨论

本研究报告了不同的分子事件驱动皮肤创伤细胞瘢痕或再生的命运。通过单细胞RNA测序、蛋白质组学和组织水平上对比了疤痕和YAP抑制诱导的伤口再生。整合这些数据来揭示纤维化和再生愈合的“分子轨迹”。研究发现，通过激活Trps1和Wnt信号，破坏YAP的机械转导可以通过成纤维细胞产生再生修复。通过在伤口的体内基因敲除和过表达，确定Trps1是一个关键的调控基因，对伤口再生是必要的和部分充分的。本研究可以作为伤口再生的多组学图谱，并可能对病理纤维化有治疗意义。

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本研究利用单细胞测序技术、蛋白组学技术、组织水平研究发现了伤口再生过程中的重要调控基因Trps1，进而推动了伤口再生的研究进展。目前单细胞测序技术已日渐成熟，而其和蛋白质组学联合应用的文章也日渐增多，可以从不同层面推动我们的机制研究，帮助广大科研工作者发表更高水平的论文。

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