Cell Stem Cell. | 疤痕的克星!单细胞转录+蛋白组研究伤口再生的多组学图谱

2022-06-29 07:49:40, 多层组学定制服务 上海欧易生物医学科技有限公司


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前言


纤维化即用无功能结缔组织替代有功能的组织,是几乎所有人体器官损伤的最终结果。疤痕是真皮损伤后的纤维化,是一种优先考虑愈合速度的晚期进化适应。


2022年2月,斯坦福大学Shamik Mascharak课题组联合在Cell Stem Cell.期刊发表的题为“Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing”(IF:24.633的研究成果,通过单细胞转录组学、蛋白质组学研究方法,发现通过激活Trps1和Wnt信号,破坏YAP机械转导可通过成纤维细胞产生再生修复,Trps1作为一个关键的调控基因,对伤口再生是必要的和部分充分的。



研究背景


疤痕缺乏皮肤毛发或腺体,因此,没有正常的体温调节或屏障功能。尽管纤维化带来了巨大的医疗负担,但由于对再生与纤维化愈合的基本机制的理解有限,目前依然缺乏针对性的治疗方案。


研究思路



研究结果


1.纤维化和再生伤口的多模式分析

由于损伤修复包括多个阶段,检测治愈过程中细胞和分子的动力学就显得至关重要了。分析了七个时间点的小鼠伤口和皮肤:UW(未受伤)皮肤、术后2天(POD2,炎症)、POD7(成纤维细胞增殖)、POD10、POD14(伤口重新上皮化,成纤维细胞产生ECM)、POD21和POD30(成纤维细胞重构ECM)。伤后立即在伤床上注射维替泊芬或对照(磷酸盐缓冲盐水[PBS])。


对照创面形成明显的纤维性疤痕,大体为裸露区域,有致密、线性排列的ECM纤维,无次级成分;相反,POD30时,经维替泊芬处理的伤口再生的毛囊(HF)和腺体水平与UW皮肤相似,且ECM纤维密度更低,方向更随机。每只小鼠三分之一的组织用于组织学研究,其余的按建立的荧光激活细胞分选(FACS)策略进行细胞分选,以分离成纤维细胞(Lin−)和其他细胞(主要是免疫细胞;Lin+)。一半细胞用于蛋白组学分析,其余的用于scRNA-seq分析;每个样本都用HTO标记,使scRNA-seq分析的细胞和同一只老鼠的蛋白组学以及组化样本相联系。


成纤维细胞在维替泊芬治疗的伤口中轻度增加;然而,对照组和维替泊芬创面的细胞比例大致相似。在主成分分析中,Lin-和Lin+蛋白质组样本在时间点上存在显著差异,而PBS和维替泊芬样本之间则无明显差异。GSEA发现PBS伤口成纤维细胞在机械激活方面富集,维替泊芬样本的伤口成纤维细胞在蛋白和代谢过程富集。


使用一种新开发的图像处理算法对受伤和UW皮肤的ECM超微结构进行了量化,确定了每个样本中结缔组织切片的294个参数,并通过t分布随机邻域嵌入进行聚类分析。随着时间的推移,对照创面ECM与UW的ECM显著区分,显示纤维化瘢痕。相反,POD14/30维替泊芬创面与UW皮肤重叠,表明维替泊芬治疗后愈合产生UW样ECM。在这两种处理中,POD7-14之间的差异最大,这与ECM沉积主要发生在这段时间相一致。


图1 | 瘢痕和再生伤口修复的多模式研究



2.识别修复的分子轨迹

成纤维细胞对机械力高度敏感,是瘢痕形成的主要驱动因素,因此假设维替泊芬通过改变成纤维细胞表型促进再生,并将scRNA-seq分析集中在成纤维细胞上。通过Monocle3来生成细胞轨迹,选择一个最优簇来最大限度地捕捉PODs之间的变化。由此产生的轨迹有两个分支,早期(POD2)成纤维细胞在分支点附近,晚期成纤维细胞在分支末端。UW皮肤成纤维细胞几乎全部位于分支末端,该分支也富含维替波芬伤口成纤维细胞。因此,可以推测分支末端一个再生修复轨迹,成纤维细胞向UW样状态发展,而分支附近是一个相对的纤维化轨迹。


图2 | 假时间内成纤维细胞转录组轨迹分析


Seurat聚类识别了6个成纤维细胞聚类:聚类0和4组成了再生部分;1、2、5构成纤维性部分;3主要由UW皮肤成纤维细胞组成。通过计算感兴趣轨迹上基因的相关性,纤维性部分富含促纤维化标志物,如Dpp4、Fap和Gpx3。GSEA中和假定时间正相关性位于前1%的基因集中于ECM聚集,生长因子、转导和纤维化相关条目。


图3 | 成纤维细胞瘢痕形成和再生过程中的假时间和CytoTRACE分析


和假定时间呈强负相关性的基因包括很多发展和再生相关的基因,同时还发现了几个参与Wnt信号转导的基因,包括Wnt靶点Axin2和Twist1;Wnt兴奋剂Rspo1等。GSEA分析与假定时间负相关相关的前1%基因,再生部分富集了骨形态发生蛋白(BMP)和Wnt相关条目。


接下来,使用SCENIC平台来比较基于基因调控网络的轨迹。Trps1、Gli1和Twist1调控蛋白在再生部分中被更多激活,进一步支持Wnt的激活。使用CellChat分析scRNA-seq数据,发现在再生部分中涉及瘢痕成纤维细胞和非典型Wnt信号的促炎信号增加。


图4 | 分析成纤维细胞相互作用


通过RNA速率分析,发现纤维部分和再生部分的RNA速度方向相反,纤维部分指向增加的PODs,而再生部分指向更早的时间点细胞。应用CytoTRACE,UW皮肤成纤维细胞分化程度最高,而伤口成纤维细胞分化程度相对较低。随着POD的增加,纤维部分成纤维细胞总体分化程度较低,分化程度增加,而再生细胞沿轨迹分化程度降低,表明随着愈合过程的进展,发育潜力增加。


接下来分别分析了组成每个轨迹的簇,并检查了每个分支上与CytoTRACE评分最相关的基因。纤维性部分评分随时间的下降主要是由ECM相关基因驱动的,与分化成成熟瘢痕成纤维细胞一致。


3.伤口纤维化和再生轨迹标记的研究

通过免疫荧光技术发现,与维替泊芬创面相比,PBS中Dpp4+细胞显著增加,特别是在真皮深层。与维替波芬抑制机械诱导一致,YAP在PBS创面中表达高于维替波芬创面或UW皮肤。Trps1在对照创面中表达很低,但在维替泊芬创面中却很高。基于人工神经网络对数千个细胞Trps1核定位的定量分析显示,在维替泊芬创面中,核Trps1+成纤维细胞数量较高。尽管如此,UW皮肤Trps1的表达仅限于基底上皮和真皮乳头,但在再生HF周围的维蒂波芬创面中发现了大量核Trps1+细胞簇。


PBS和维替泊芬治疗伤口的一个显著区别是后者在30天内出现再生HF,而前者形成裸露区域。Trps1,在HF发育中起关键作用,是最重要的候选因子。多项研究表明,Trps1与HF的形态发生有关,而异常的Trps1活性与人类毛发过度生长的条件有关,这些研究使Trps1成为一种很有前途的推动伤口HF再生的候选因子。支持这一假设的是,Trps1+细胞在再生伤口中富集,并在空间上聚集在新发性HF周围。鉴于再生轨迹的特点是机械转导减少和Trps1升高,我们推测Trps1可能是伤口再生的关键调控因子。


基于多模式分析,研究者选择4个标记来区分和代表纤维化和再生之间的通路:Ankrd1,Trps1,Rspo1和Dpp4。为了探测关键基因的空间分布,研究者上述4种标记进行了多重RNAscope原位杂交;为了聚焦于真皮成纤维细胞,进行了真皮受限的形态学重建。在POD 14维替波芬创面中,在真皮浅表层中发现含有Rspo1和Trps1 RNA颗粒的成纤维细胞聚集在内陷上皮周围,与新发HF一致。


相反,在POD14 PBS创面中,Rspo1+和Trps1+细胞随机分布于真皮。在POD 30,纤维化/再生创面之间表型分化最大的时候,PBS创面成纤维细胞有更多的Dpp4和Ankrd1,而维蒂泊芬创面有更多的Rspo1和Trps1 RNA颗粒,集中在再生HF周围。


图5 | 瘢痕形成和再生过程中成纤维细胞的空间转录组分析



4.确定Trps1在再生中的功能意义

为了确定Trps1在伤口再生中的作用,研究者首先进行了成纤维细胞特异性Trps1 OE,以评估在正常瘢痕条件下,Trps1是否足以用于伤口再生。为了证实特异性,非成纤维细胞标志物的IF染色显示GFP信号仅存在于成纤维细胞中,而不在内皮细胞、脂肪细胞、上皮细胞或免疫细胞中。


通过在早期(POD3和7)和晚期(POD7和17)中过表达Trps1,Trps1-OEC创面形成瘢痕,而Trps1-OEE和Trps1-OEL创面瘢痕不明显,HF再生较少。组织学证实Trps1表达增加,并显示在Trps1-OEE和Trps1-OEL伤口中有少量再生附属结构和更多的UW样ECM。这些发现从定量上证实HF/腺体明显增加,ECM评分显著更高。与Trps1-OEE相比,Trps1-OEL伤口的再生更为显著,这表明Trps1的促再生作用可能在早期愈合时是最显著的。


为了评估Trps1对维替波芬诱导的伤口再生是否必要,开发了FLEXon EGFP: miR30-mTrps1慢病毒载体,敲除早期(POD−3/7;Trps1-KDE)和晚期(POD 7/17;Trps1-KDL)的Trps1。对照注射FLEXon EGFP:Scramble miR30慢病毒。POD 30时收集伤口。Trps1-KDC创面表现为毛发再生和无瘢痕,而Trps1-KDE和Trps1-KDL创面形成无毛疤痕。Trps1-KDE和Trps1-KDL损伤完全破坏ECM再生,取而代之的是疤痕ECM。


有趣的是,仅在Trps1- KDL伤口中观察到附属结构的显著损失,这意味着在愈合后期,为维蒂波芬诱导的附属再生,Trps1是明确需要的。综上所述,这些数据表明,Trps1对于完全的伤口再生是必要的,在早期和晚期愈合中具有独特的作用。


图6 | 成纤维细胞靶向慢病毒Trps1过表达和敲除



研究讨论


本研究报告了不同的分子事件驱动皮肤创伤细胞瘢痕或再生的命运。通过单细胞RNA测序蛋白质组学和组织水平上对比了疤痕和YAP抑制诱导的伤口再生。整合这些数据来揭示纤维化和再生愈合的“分子轨迹”。研究发现,通过激活Trps1和Wnt信号,破坏YAP的机械转导可以通过成纤维细胞产生再生修复。通过在伤口的体内基因敲除和过表达,确定Trps1是一个关键的调控基因,对伤口再生是必要的和部分充分的。本研究可以作为伤口再生的多组学图谱,并可能对病理纤维化有治疗意义。



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本研究利用单细胞测序技术蛋白组学技术、组织水平研究发现了伤口再生过程中的重要调控基因Trps1,进而推动了伤口再生的研究进展。目前单细胞测序技术已日渐成熟,而其和蛋白质组学联合应用的文章也日渐增多,可以从不同层面推动我们的机制研究,帮助广大科研工作者发表更高水平的论文。


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