Nature | 为啥喝奶茶容易长胖？原来是膳食果糖改善了肠道细胞存活和营养吸收

2022-06-12 10:27:24, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

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前言

2021年8月，来自美国威尔康奈尔医学院威内分泌科的Marcus D Goncalves教授团队在Nature期刊发表的题为“Dietary fructose improves intestinal cell survival and nutrient absorption”的研究成果，该研究以小鼠为研究对象，运用代谢组学分析等研究方法，发现果糖衍生的F1P抑制 PKM2（M2-型丙酮酸激酶），可促进肠道中缺氧细胞的存活，增加肠绒毛长度，使得肠道的表面积扩大，从而促进了营养吸收。同时，这一研究为肠道肿瘤的治疗提供了一种新靶点，即通过缩短绒毛，从而减少脂肪吸收，减缓肿瘤生长。

基本信息

中文标题：膳食果糖改善肠道细胞存活和营养吸收

研究对象：小鼠

发表期刊：Nature

发表时间：2021年8月18日

影响因子：49.962

运用主要组学生物技术：代谢组学、转录组学

研究背景

农业和工业的发展提高了甜味剂的获取，果糖的总消耗量增加，导致肥胖症和相关疾病迅速流行。全球肥胖人数的上升和与肥胖相关的癌症如结直肠癌的增加直接相关，这些癌症在年轻人中的发病率和死亡率都在上升。一些观察结果表明，果糖的摄入和结直肠癌之间存在因果关系。例如，果糖消耗与胃肠道癌症的发生和进展有关，并在结直肠癌小鼠模型中发现其能够驱动肿瘤生长和转移。由于肿瘤生长是由细胞增生驱动的，并且肿瘤细胞往往保留来自其起源组织的代谢途径，因此一个合理的假设是果糖会促进正常肠上皮的增生，就像它促进肠肿瘤的生长一样。为了验证这一点，来自美国威尔康奈尔医学院的 Marcus D. Goncalves 团队进行实验设计，并利用代谢组学、转录组学等组学方法进行了深入研究。

研究思路

研究结果

膳食果糖可增加肠绒毛长度和促进营养吸收

首先，给予小鼠高果糖玉米糖浆（HFCS）喂食四个星期，并使用高通量、基于图像分割的方法量化平均肠绒毛长度。研究结果表明，与对照处理的小鼠相比，HFCS 处理小鼠的十二指肠和近端空肠中的肠绒毛长度增加了 25-40%（图1a）。绒毛长度的增加与体重增加、脂肪积累以及脂质吸收的增加相关。作者认为，这种由肠绒毛增长导致的吸收增加会促进小鼠的体重增长，并在后续实验中，对小鼠进行了不同的饮食处理加以验证。

饮食处理中，三组小鼠分别接受不含果糖的对照饮食、含果糖的高脂饮食（HFD）、以及含葡萄糖或蔗糖但不含果糖的等热量 HFD 处理。结果表明，尽管饮食中热量水平相当，但食用果糖的小鼠体重和脂肪量明显高于食用蔗糖/葡萄糖的小鼠（图1b,c）。同时，与接受蔗糖喂食的小鼠相比，接受果糖喂食的小鼠虽然小肠长度相似但肠绒毛更长（图1d），口服脂质后血清甘油三酯水平升高程度更高（图1e），粪便中排出的能量更少。这些数据表明，膳食果糖可增加肠绒毛长度和促进营养吸收。

细胞存活是果糖处理条件下绒毛肥大的主要决定因素

肠绒毛的长度是由上皮细胞增殖率和死亡率之间的平衡决定的。因此，随着隐窝内的干细胞分裂产生新的肠上皮细胞（IECs），绒毛不断处于自我更新的状态，这些细胞随后向外迁移，直到到达绒毛顶端并被挤压入肠管。为了确定绒毛变长是由于迁移速率（即增殖）的增加还是细胞存活率的增加，作者在几个不同的时间点分别注射5-溴-2''-脱氧尿苷（BrdU）和 5-乙炔基-2''-脱氧尿苷（EdU）进行了单标和双标示踪实验。

这些测定结果表明，与对照组小鼠相比，HFCS 处理小鼠的十二指肠绒毛具有相似的迁移率，但存活时间超过72小时的肠上皮细胞是对照小鼠的两倍多（图1f,g）。通过组织学 Ki-67 染色评估的细胞增殖也表现出一致的结果。这些数据表明细胞存活是果糖处理条件下绒毛肥大的主要决定因素。

细胞沿肠绒毛运输，最终细胞死亡并挤压进入肠管。事实上，在组织学切片捕获的所有挤压细胞中，凋亡标志物cleaved caspase-3 （CC3）或末端脱氧核苷酸转移酶标记（TUNEL）均呈阳性，而与饲料无关（图1h）。由于肠上皮细胞在沿着绒毛运输的过程中远离其血液供应，这种细胞的死亡很可能受到组织缺氧的影响。与这一理论相一致的是，吡咪唑染色（用于指示组织中氧的分压小于10毫米汞柱），与H2O处理和HFCS处理的小鼠小肠和大肠肌层的距离相关（图1i）。

图1 | 果糖增加了肠绒毛长度和脂质吸收

（a）摄入水或高果糖玉米糖浆4周的健康小鼠的小肠（苏木精和H&E染色）低倍和高倍图像。

（b）喂食对照组、高脂饮食(HF)和高脂高糖饮食（HFHS）的小鼠体重的相对变化。

（c）每次饮食5周后，三组小鼠从性腺储存处获得的大量白色脂肪组织。

（d）各组5周后十二指肠绒毛的相对长度。

（e）小鼠空腹口服脂质后血清甘油三酯水平。

（b-e）单因素方差分析之后是Holm-Sidak多重比较的事后检验（NS：不显著；*P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001）。

（f）腹腔注射BrdU 72小时后，H2O和HFHS处理的小鼠十二指肠切片的BrdU免疫组化（IHC）。

（g）注射BrdU后的十二指肠绒毛长度（双侧T检验）。

（h,i）H2O处理的小鼠十二指肠部分CC3 (h)和吡咪唑(i)的免疫组化。

转录组分析和差异表达基因

由于缺氧是多种组织和环境中细胞死亡的驱动因素，接下来将验证果糖是否能够延缓缺氧条件下细胞的死亡。实验中，添加果糖并不影响细胞生长速度，但确实提高了缺氧条件下HCT116和DLD1（结肠癌细胞）的存活率（图2a,b）。果糖还能提高缺氧小鼠肠道类器官的存活率。缺氧诱导了类器官核心（与绒毛相对应的形态）的强烈凋亡，这反映在CC3（凋亡标志物）强度的增加和活细胞数量的减少，而这些变化被果糖消除。作者观察到进行果糖处理没有增加类器官的增殖，这表明果糖的好处主要是在这种情况下增加了细胞的存活。

果糖主要通过糖转运体GLUT5运输到肠道细胞，然后被KHK磷酸化形成果糖1-磷酸（F1P）。在人类的CRC（结直肠癌）细胞中，无论是添加果糖还是进行缺氧暴露处理，KHK的总水平都是一致的，而缺氧导致GLUT5丰度的增加。值得注意的是，氯化钴处理可使HIF-1α（缺氧诱导因子）具有较强的稳定性，但没有诱导GLUT5的上调，这表明GLUT5的表达与HIF-1α蛋白水平无关。我们还注意到KHK-A在人的CRC细胞缺氧时的强烈表达，并证实外源性果糖被转化为F1P（图2c），但果糖的碳原子没有被纳入下游糖酵解中间体。这与观察到的一致，即在缺氧条件下培养的人CRC细胞或小鼠肠道类器官的培养基中，果糖不会耗尽。事实上，果糖的直接代谢物只能解释与果糖暴露在缺氧状态相关的独特代谢特征的一小部分。然而，在低氧的HCT116细胞中，上糖酵解中间产物增加，丙酮酸与磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的比例显著降低（图2d），这与丙酮酸激酶被抑制导致的结果是一致的。丙酮酸激酶是糖酵解过程中将丙酮酸转化为PEP的最终限速酶，而M2亚型（PKM2）的丙酮酸激酶的活性对细胞内代谢产物的变化高度敏感。此外，PKM2在受缺氧影响的组织中表达高，如肿瘤和肠绒毛。使用酶分析，证实了暴露于果糖的CRC细胞裂解液和喂食HFCS的小鼠的IEC（肠上皮细胞）裂解液中丙酮酸激酶的抑制作用（图2e,f）。

由于 F1P（果糖1-磷酸）在结构上类似于PKM2的内源性调节因子 1,6-二磷酸果糖（FBP），因此作者假设F1P可能直接抑制PKM2的活性。FBP在离活性位点较远的调控袋中与PKM2紧密结合，使PKM2稳定在一个高活性四聚体中。对接模拟显示，F1P可以占据同样的口袋，但缺乏与相邻肽环相互作用所必需的向外的磷酸基，而磷酸基对四聚体的形成至关重要。与此机制一致，发现F1P强抑制PKM2，但不抑制PKM1，而PKM1缺乏FBP结合的口袋（图2g,h），这种抑制伴随着四聚酶与单体酶的比例下降（图2i）。

相比之下，PKL（一种带有改良型FBP结合袋的丙酮酸激酶同工酶），仅被F1P部分抑制。在一个FBP无反应的PKM2突变体中，仍然发现了强烈的抑制作用，这些表明，F1P会与FBP竞争结合PKM2的同一位点，而且一旦结合就能够直接抑制PKM2的活性。与此同时，也发现F1P和位于结合袋深处的Ser519-a残基之间的相互作用对于抑制是至关重要的，因为该丝氨酸残基突变为丙氨酸，会在保持FBP激活的同时减弱了F1P抑制。

图2 | 果糖代谢提高缺氧细胞存活率，降低丙酮酸激酶活性

（a）缺氧条件下HCT116细胞的情况（Fru为果糖）。

（b）在含果糖/不含果糖，常氧/缺氧的葡萄糖培养基中培养的HCT116细胞的细胞毒活性染色强度（Glc：葡萄糖；Stau,：stausporin control）。

（c）低氧的HCT116细胞中代谢物的定量（F1P离子计数）。

（d）通过液相色谱-质谱（LC-MS）检测低氧的HCT116细胞中丙酮酸与PEP的比值。

（e,f）丙酮酸激酶（PK）在低氧条件下HCT116和DLD1细胞裂解液和IEC裂解液中的活性，这些小鼠饲喂指定的饲料(葡萄糖或葡萄糖+果糖(e)；H2O或HFCS (f)）。

（g,h）重组丙酮酸激酶同工酶的丙酮酸激酶活性（PKM1(g)；PKM2(h)）。

（i）使用与戊二酸二琥珀酰亚胺交联的重组PKM2样品对PKM2进行免疫印记（T、D和M表示四聚体、二聚体和单体PKM2的假定大小）。

丙酮酸激酶的激活降低了果糖对缺氧生存的影响

F1P的抑制作用也可以通过使用小分子TEPP-46在远离FBP口袋的位置激活PKM2来克服（图3a）。为了测试PKM2的活性是否会影响细胞和组织中果糖的作用，首先在HCT116细胞中使用shRNA 敲除PKM2的mRNA，并将这些细胞暴露在果糖存在或不存在的缺氧环境中。在PKM2耗尽的情况下，果糖不再改善缺氧细胞的存活（图3b）。同样，当使用TEPP-46激活细胞中的PKM2时，果糖的作用大大减弱（图3c）。这些数据表明，PKM2是果糖诱导细胞存活的关键中介。

对刺激作出反应而改变活性和构象的能力可能解释了PKM2在迅速分裂的组织中的高表达，这些组织必须应对营养和氧的限制才能继续生长。例如，在低氧状态下，PKM2的抑制可减轻活性氧，从而提高细胞存活。与这一作用相一致的是，作者观察到果糖降低了缺氧细胞中H2O2的总量，这种作用被PK（丙酮酸激酶）的激活所消除，而在PKM2敲除的细胞中没有观察到。PKM2的单体和二聚体还可以结合并反转录HIF-1α， HIF-1α是缺氧适应的关键转录因子。因为F1P触发了这些低阶PKM2的形成，作者假设果糖会增加HIF-1α的反转录活性。事实上，低氧和常氧的HCT116细胞暴露于果糖中会增加HIF-1α的转录活性，而这一结果被两种结构不同的PK激活剂消除（图3d）。此外，HIF-1α的活性与细胞内ATP水平、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路以及缺氧时乳酸的产生相关（图3e），与HIF-1α在细胞代谢重组中的作用一致。总之，数据表明，F1P是PKM2的抑制剂，它可以增强HIF-1α的活性，从而促进缺氧细胞的存活。

PKM2在果糖生理反应中的重要性通过遗传小鼠模型得到证实。在IECs（肠上皮细胞）中，PKM2的选择性缺失（Vil1Cre/+；Pkmtm1.1Mgvh/tm1.1Mgvh老鼠，简称Vil1Cre/+，Pkm2f/f 老鼠）导致PKM1的强烈上调和上皮中丙酮酸激酶活性的增加，也改变了丙酮酸激酶的核定位。这些小鼠以及缺乏KHK的小鼠的绒毛都很短，在HFCS存在时无法伸长（图3f），这表明F1P和PKM2都是必需的。此外，缺乏PKM2或KHK的小鼠不上调GLUT5或HIF-1α靶向蛋白，并且在喂食HFCS后也免受脂质摄取和脂肪积累增加的影响。

PKM2的药理激活也极大地改变了果糖在肠道中的作用。即使剂量远低于要求保持有效的血清水平的药物，TEPP-46处理的小鼠有更高的肠道丙酮酸激酶活性，并免受HFCS诱导的绒毛伸长的影响（图3g）。在小鼠身上重复了这个实验，小鼠每天口服一次HFCS，使其摄入量更接近典型的人类摄入量。在该模型中，HFCS喂养的小鼠在治疗第10天出现了延伸至回肠的绒毛伸长，这可以通过同时注射TEPP-46来预防和逆转。与转基因小鼠一样，TEPP-46抑制了HFCS诱导的脂质吸收和脂肪积累的增加（图3h）。

鉴于PK激活对正常上皮组织的影响，作者假设这种方法也可能抑制肠道肿瘤的生长。肠肿瘤起源于隐窝和绒毛内的肠上皮细胞，因此低氧应激可能是其发展和进展的限制因素。与这一理论相一致的是，作者观察到在原发性人结直肠癌中PKM2和其他HIF-1α靶点比正常的邻近上皮细胞表达量高。此外，这些肿瘤中丙酮酸激酶的活性相对于邻近组织被抑制，这可能提供了缺氧的生存优势。在小鼠肠道肿瘤中，发现肿瘤核心和周边缺氧区域，有许多凋亡细胞，以及GLUT5上调。为了测试丙酮酸激酶的激活是否能抑制肿瘤生长，将含或不含TEPP-46的HFCS喂给一个易诱发肿瘤突变的小鼠（ApcQ1405X/+）。

与之前的发现一致，HFCS导致更严重的肿瘤负担和贫血，这一并发症在该模型和人类中与更严重的疾病和更低的生存率有关。这些变化都可以通过使用低剂量的TEPP-46来预防（图3i-k）。

图3 | PK（丙酮酸激酶）的激活降低了果糖对缺氧生存的影响

（a）被不同浓度的F1P培养的重组PKM2的PK活性(F1PM表示F1P的摩尔浓度)。

（b）在有或没有果糖的缺氧条件下，使用指定的shRNA经病毒转导后HCT116细胞的活性（shScr：对照组，使用没有针对性的shRNA；shPKM2：针对KPM2的shRNA)。

（c）HCT116细胞在含果糖或不含果糖、TEPP-46或对照二甲亚砜（DMSO）的缺氧条件下培养的存活率。

（d）转染为firefly荧光素酶HIF-1α报告因子（p2.1）和Renilla荧光素酶组成报告因子（pRL）后HCT116细胞的相对发光。

（e）在指定条件下培养24小时的HCT116细胞的ATP水平（DASA-58和TEPP-46为PKM2的激活剂）。

（f）自由饮水或高果糖玉米糖浆4周后，指定基因型小鼠十二指肠绒毛的相对长度（WT：野生型）。

（g）用指定的饮食治疗4周，野生型小鼠的十二指肠绒毛。

（h）小鼠口服脂质后血清甘油三酯（TG）水平的变化。

（i）ApcQ1405X/+小鼠的代表性肠道使用指定的方案进行治疗（箭头表示肿瘤）。

（j）15周时小鼠大小肠组织切片的总肿瘤面积。

（k）15周时小鼠大小肠组织切片的红细胞（RBC）计数。

相关讨论

总之，这些发现表明果糖促进肠道内缺氧细胞的存活。这一结论为表明果糖代谢在不同的生物环境中是氧感的重要组成部分提供了新的证据。例如，内源性产生的果糖对裸鼹鼠在低氧洞穴中的生存至关重要，在小鼠心肌细胞缺血后也至关重要，但这些相互作用背后的机制尚不清楚。果糖衍生的F1P抑制PKM2（PKM2是缺氧适应中的一种重要酶）的发现，为这些观察提供了额外的见解。鉴于其在体循环中的相对稀缺，内源性果糖可以作为缺氧时细胞代谢重编程的高度特异性信号，由此认为，当组织如肠绒毛和肿瘤暴露于外源性果糖时，这种机制是有作用的（和可靶向的）。此外，肠道细胞存活的结果是肠道表面积的扩大，从而提高了营养物质吸收的发现，可能有助于解释果糖在母乳喂养的婴儿中促进生长、以水果为食物的冬眠动物的肥胖增加以及高果糖饮食的致肥特性中的作用。

研究结论

研究中的这些发现表明果糖衍生的 F1P 抑制 PKM2，可促进肠道中缺氧细胞的存活，增加肠绒毛长度，肠道表面积扩大，从而促进了营养吸收。此外，已经有一些药物在临床试验中以产生F1P的酶为靶点。希望能够找到一种方法重新利用它们来收缩绒毛，减少脂肪吸收，并可能减缓肿瘤生长。

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本研究以小鼠为实验对象，通过饮食控制设计了不同的对比实验，并使用了代谢组学、转录组学等多种组学方法来进行分析。从而在研究中得出了果糖衍生的代谢物果糖-1-磷酸能够抑制糖酵解过程中的限速酶PKM2，可增加肠绒毛长度和促进营养吸收。如今，果葡糖浆已经成为现代食品工业的新宠；一些酸奶当中，都有果葡糖浆的存在。这一发现有助于解释添加大量果糖甜味剂的饮食下肥胖率的上升，也为高果糖饮食促进肿瘤生长提供了一个新的理解角度。

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部分参考资料

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