EST | 16s+GC-MS代谢组学探究AgNPs暴露对土壤微生物的影响，再登环境科学TOP期刊！

随着纳米材料的产业化,各种形式的纳米材料将以不同途径进入人们的生活,纳米材料的生物安全性问题正受到世界各国科学家的广泛关注，本篇为2020年2月，南京大学环境学院课题组在Environmental Science & Technology杂志（IF=9.028）发表题为“Silver Nanoparticles Alter Soil Microbial Community Compositions and Metabolite Profiles in Unplanted and Cucumber-planted Soil”的研究论文。该研究运用16S rRNA基因测序、GC-MS非靶向代谢组技术对土壤微生物组和代谢组学分析技术的独特结合，提供了对AgNPs生态影响的全新视角，全面了解了AgNPs暴露对土壤微生物的影响。

银纳米颗粒（AgNPs）是使用最广泛的工程纳米材料之一，泄露可能导致颗粒在土壤中积累，并对环境造成未知风险。有报告指出AgNPs可能通过影响根系分泌物间接对微生物群落功能和基因组多样性产生显著影响，但对其机理了解甚少。土壤代谢物可作为土壤微生物群落变化的表型特征，但当前有关NPs暴露对土壤微生物群落影响的研究不包括对土壤代谢产物的分析。16S rRNA基因序列可以提供改变的土壤微生物群相关信息，鉴于它们的已知功能，人们可以对土壤生物化学的变化提出合理假设。本文作者利用16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学方法，研究了AgNPs对土壤微生物群落的长期影响。

1.实验分组

四种处理方法：A组-土壤，B组-土壤+100 mg / kg AgNPs，C组-土壤+植物，D组-土壤+植物+100 mg / kg AgNPs，每种处理均重复四次。

2.土壤化学分析

土壤pH值、溶解的有机碳、常量/微量元素含量。

3.黄瓜叶片生化分析

光合色素、总酚含量、脂质过氧化作用

4.土壤代谢组学

GC-MS非靶向代谢分析

5.土壤微生物群落多样性和组成分析

16S rRNA基因测序

6.数据分析

①代谢组数据：有监督的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）聚类，VIP值大于1筛选对分类有贡献化合物，使用MetaboAnalyst 4.0进行生物途径富集分析，筛选阈值0.1。

②其他数据：MDA、光合色素和土壤养分元素、TOC和pH的含量进行单变量统计分析（p<0.05）。

1.AgNPs对土壤化学性质的影响

暴露于AgNPs 60天后，作者评估了土壤溶解的有机物含量（DOM）、pH值和元素含量。结果表明无论是否种植植物，暴露于AgNPs的土壤pH值均会增加，但土壤DOM不会改变。但种植黄瓜的土壤中，被测元素的生物利用度随AgNPs的存在而显著增加（表1）。

表1 | 土壤中可提取的常量和微量元素（mg / kg干重）

2. 未种植黄瓜的土壤中微生物群落对AgNPs的响应

为了确定土壤微生物群落对AgNPs暴露的响应，作者在IIIumina MiSeq平台上进行了高通量土壤细菌16S rRNA基因测序。在AgNPs处理和未处理的土壤中，变形杆菌、放线菌、酸性杆菌、绿弯曲菌、拟杆菌和芽孢杆菌是最重要的菌群。PCoA结果表明，AgNPs显著改变了土壤细菌群落结构（p=0.035）。暴露在AgNPs下，土壤细菌群落每个分类的丰富度显著增加（图1）。

图1 | 微生物群落丰富度（Sobs指数）

众所周知，AgNPs具有微生物毒性。作者发现丙酸杆菌、降解几丁质并水解纤维素的微生物、多糖水解有关的微生物、降解高分子量化合物的拟杆菌、碳循环相关细菌群的相对丰度发生了变化，AgNPs暴露可能会对土壤微生物组中的糖和有机酸代谢产生负面影响，随之对碳转移、代谢、储存和土壤有机碳库组成产生潜在影响。AgNPs暴露也对土壤中氮循环相关的微生物群，以及生物和非生物胁迫的耐受性的微生物群产生了负面或正面影响（图2）。另外发现污染物降解相关的微生物也明显减少。总之，AgNPs暴露改变了参与碳、氮和磷循环，病原体抗性和污染物降解的细菌群的相对丰度。

图2 | AgNPs存在的情况下，相对丰度发生显著变化的微生物分类热图

3.种植黄瓜的土壤中微生物群落对AgNPs的响应

在种植黄瓜的土壤中，主要的微生物群落与未种植的土壤相同，并且AgNPs暴露显著（p=0.034）改变了土壤微生物群落结构，表明不论植物存在与否，AgNPs暴露都会显著改变土壤微生物组成。

与未种植黄瓜的土壤相反，种植黄瓜的土壤暴露于AgNPs后，各个水平（从门到属）的土壤微生物群落丰富度均显著降低（图1）。对实验结果分析发现AgNPs也可能损害黄瓜种植土壤中的碳、氮和磷循环相关微生物群，表明植物在减弱AgNPs暴露对土壤微生物群落的负面影响方面发挥的作用有限。但鞘氨醇单胞菌和鞘氨醇单孢菌科微生物群例外，其相对丰度在未种植的土壤中显著降低，但在种植黄瓜且暴露于AgNPs的土壤显著增加（图2II）。

有几种微生物相对丰度仅在种植黄瓜的土壤中显著降低（图2II），包括叶绿单胞菌类（厌氧科和叶绿藻）、变形杆菌属类（粘球菌）和吡喃单胞菌类。表明在植物存在下，AgNPs暴露可能会对土壤碳水化合物的代谢和污染物的降解产生负面影响，进而对植物代谢、生长和对病原体抗性产生重大影响。

4.未种植黄瓜土壤中代谢产物对AgNPs的响应

土壤代谢物可以间接反映微生物代谢过程的变化，使用基于GC-MS的非靶向代谢组学，在土壤样品中共鉴定272种代谢物并对其进行非靶向代谢组学定量，定量结果表明AgNPs暴露显著改变了土壤代谢物的分布。通过参数VIP>1.5，在土壤中鉴定出20种具有重要变化的代谢物（图3I），除少数几个代谢物上调，大多数代谢物减少，表明AgNPs暴露通常会对土壤微生物的代谢产生负面影响。

值得注意的是，在AgNPs暴露后，许多脂肪酸及其前体含量显著降低，包括十五烷酸、棕榈油酸、亚油酸、棕榈酸、十七烷酸和油酸（图3I）。微生物会在不同环境条件下产生不同链长和组成的磷脂脂肪酸（PLFA），以维持细胞膜的完整性和细胞功能。PLFA的改变可能是由于AgNPs诱导ROS过度生成，氧化微生物细胞膜上的脂肪酸。微生物群落可调节膜PLFA以响应AgNPs诱导的应激反应。PLFA也可用于估算土壤中的生物量，PLFA水平降低可能表明AgNPs降低了微生物生物量。

在AgNPs暴露后，特定糖和氨基酸的含量也发生显著改变。例如半胱氨酸-甘氨酸的上调可能表明土壤微生物群落某些成员的抗氧化防御系统被激活，木糖内酯减少可能表明微生物的脱氢酶活性受到损害，多糖N-乙酰基-D-甘露糖胺显著降低和其他多糖的下调印证了AgNPs对土壤碳循环的负面影响。

生物途径分析表明，5条与碳代谢相关的微生物代谢途径发生了显著改变，包括氨基糖和核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、嘧啶代谢和谷胱甘肽代谢。表明暴露于AgNPs显著影响微生物基本代谢过程，尤其是碳代谢。

土壤代谢组学可以揭示土壤微生物群落如何在分子水平上应对AgNPs并作出反应，包括毒性机制和解毒策略。

5.种植黄瓜土壤中代谢产物对AgNPs的响应

植物不断向根际分泌大量代谢产物，在植物存在的情况下，土壤代谢产物由植物分泌的代谢产物和微生物群落的外源代谢产物组成。结果表明，种植黄瓜的土壤在AgNPs暴露中也改变了代谢产物的分布。PLS-DA得分图显示土壤+植物+ AgNPs组与土壤+植物组可明显分开，表明暴露于AgNPs下的根际代谢组与对照组有很大区别。其中一些代谢物与未种植黄瓜土壤中的代谢产物重叠，例如在黄瓜种植的土壤中也观察到脂肪酸显著减少（图3II），表明植物根系分泌物不会显著改变AgNPs对土壤微生物的负面影响。

还有一些代谢物仅在黄瓜种植的土壤观察到变化，包括上调的蔗果三糖、羊毛甾醇、果糖-1-磷酸、槐糖、葡萄糖；下调的木糖酸、富马酸、左旋葡聚糖、γ-氨基丁酸、瓜氨酸和β-丙氨酸。表明AgNPs显著改变了根分泌物的组成，间接影响微生物群落。

另外作者发现AgNPs暴露显著降低了黄瓜组织（根，茎和叶）的生物量，表明具有明显的植物毒性。虽然叶绿素含量没有变化，但是黄瓜叶片中MDA的水平显著增加，表明发生了脂质过氧化。另外黄瓜叶片中的总酚类（抗氧化剂中的抗氧化剂成分）也显著增加，表明AgNPs诱导了黄瓜植株的氧化胁迫。

图3 | PLS-DA筛选出的代谢物（VIP值≥1或1.5）热图

6.植物是否在土壤中吸收或释放代谢产物

通过PLS-DA模型可以得知植物根际土壤和未种植土壤的代谢产物分布显著不同，在植物存在下，很多代谢产物显著增加（图3III），表明植物释放的代谢产物比土壤微生物贡献的更多。有机酸、糖、脂肪酸和氨基酸表达增加，为土壤微生物群落提供了丰富的碳和能量来源。

作者使用16S rRNA测序和土壤代谢组学，评估了AgNPs暴露对种植和未种植植物的土壤中微生物群落的影响，发现：

①AgNPs改变了细菌群落结构和丰富度，在某些关键的有益/功能细菌中诱导了重大转变，例如涉及碳、氮和磷循环和病原体抑制的细菌。

②在种植植物的土壤中，土壤微生物组中的变化可能会通过影响养分获取、生物控制和胁迫耐受性的关键功能而损害植物的生长。

③无论种植植物与否，AgNPs暴露都会改变土壤代谢产物的分布，表明微生物群落的活性和代谢过程受到干扰。

本文是南京大学环境学院研究纳米材料对植物代谢组影响的系列文章之一，与以往关注植物本身代谢组变化的角度不同，这篇文章着眼于植物根际微生物在银纳米材料下的变化。土壤微生物组和代谢组学分析技术的独特结合，提供了对AgNPs的生态影响的全新视角，全面了解了AgNPs暴露对土壤微生物的影响，对分析其他非生物因素对环境影响提供了有价值的策略和思路。

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