中药入血成分分析经典研究案例 | 教你写好成分分析文章

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研究背景

中药疗效确切、安全性高、副作用小，其多成分多靶点的作用特点已被广泛接受。研究表明中药原型入血成分和代谢产物均可能是有效活性成分，因此越来越多的中药科研工作者展开了对中药入血成分的分析研究。但据笔者了解，很多研究者并不清楚如何利用自己的研究数据去写好相关的文章。为此，本期鹿明生物小编为大家整理了一篇：可以教大家写好一篇中药入血成分分析类型文章的完美案例推文，以供大家参考。

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前言

2022年08月，吉林延边大学药学院郑教授课题组在“Food Research International”期刊（IF：7.452）发表的题为 “Comprehensive characterization of the chemical composition of Lurongdabu decoction and its absorbed prototypes and metabolites in rat plasma using UHPLC–Q Exactive Orbitrap–HRMS”的研究成果，通过高灵敏度的UPLC-HRMS的研究方法来准确地识别“鹿茸大补汤（LRDBD）”的物质基础，鉴定了122种成分，其中在血浆中鉴定出29种原型入血成分和35种代谢产物。为进一步发现潜在的药物靶点和揭示LRDBD在哮喘治疗中的作用机制提供了基础数据和方法。

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研究思路

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研究方法

研究材料

（1） 标品：标准物质，包括甜菜碱、鸟嘌呤、腺苷、（+）-儿茶素、苦杏仁苷、柚皮素和薯蓣皂苷，均购自成都普斯生物科技有限公司（中国四川）。DL-哌啶酸、L-（-）-苹果酸、次黄嘌呤、尿苷、2′-脱氧核苷、异亮氨酸、（-）-epicatechin、d-酪氨酸、d-脯氨酸、d-组氨酸和甲酸盐（纯度≥98%）购自阿拉丁试剂有限公司（上海）；

（2） 生药水提物：LRDBD水提物；8种单味草药水提物；

（3） 血浆样本：LRDBD给药组（14只大鼠），生理盐水组（8只）。

研究技术

（1） 采集/数据处理：UHPLC–Q Exactive Orbitrap–HRMS 液质联用技术，QI软件/CD软件；

（2） 数据分析：PCA、火山图；

（3）数据库：mzCloudTM、mzVault、TCM、TCMSP、TCMIP数据库匹配。

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研究结果

1、在LRDBD中主要成分鉴定122种

LRDBD的含量采用高分辨率质谱法进行分析，对每个峰对应的化合物进行了初步鉴定。具体的鉴定步骤如下。首先，根据TCMSP和TCMIP建立8种单一草药的化学成分数据库。然后，使用CD筛选平台对MS数据进行处理和分析，结合在线（mzCloud、mzVault），以匹配片段信息并识别化合物结构。然后，根据准一级精确质量和二级碎片（匹配分数大于85，误差小于5.0 ppm）鉴定。图1显示了LRDBD在正离子和负离子模式下的UHPLC-MS基峰强度（BPI）色谱图谱。

此外，利用HMDB数据库和ChemDraw Pro对异构体的分化进行了补充。基于上述鉴定策略，初步鉴定了LRDBD的122种化合物（详细信息见表1），包括氨基酸、哌啶生物碱、季铵生物碱、有机胺生物碱、有机胺生物碱、苯丙类、嘌呤生物碱、黄酮、脂肪酸及其衍生物、香豆素、氰藻苷、茚生物碱、甾体、同异黄酮等。

图1 通过UHPLC-HRMS分析得到的LRDBD的

基峰强度（BPI）色谱图

A: 正离子扫描，B：负离子扫描

表1利用UHPLC–Q Exactive Orbitrap–HRMS鉴定LRDBD的化学成分。

a通过与标准品比较确定；b鹿角绒；c盾叶薯蓣；d苦艾；e麻黄；f杏仁仁；g麦冬；h芦笋；i五味子的煎煮过程中产生的新成分

1.1对LRDBD中主要成分进行来源归属

使用UHPLC–Q Exactive Orbitrap–HRMS对八种单一草药煎剂进行分析。然后LRDBD化合物的相对来源也得到了证实。8种单药草在正、负离子模式下的BPI色谱图见图2。

图2  用UHPLC-HRMS分析获得的8种单一草药的BPI色谱图

1.2对LRDBD中主要成分进行标品比对确认

根据保留时间、一级分子量的准确测定，以及MS2片段（二级碎片）与标准品的比较结果，准确鉴定了LRDBD中的17个化合物（见图3）。

图3 基于与参考标准品比较的化合物鉴定

1.3对LRDBD中122种化学成分进行结构明确

为了明确所鉴定122种化合物的结构，图4展现了鉴定的化合物的主要结构分类：图4显示了主要成分的化学结构分类。根据取代基的不同，鉴定出10种氨基酸、1种哌啶生物碱、2种季铵生物碱、6种有机胺生物碱、3种苯丙烷类、8种嘌呤生物碱、14种黄酮类化合物、17种脂肪酸化合物及其衍生物、3种香豆素类、2种氰基糖苷、2种吲哚生物碱、5种类固醇和2种同源异黄酮。

图4在LRDBD中鉴定的主要成分的化学结构

另外，还鉴定出了其他43种化合物，如图5所示。包括氨基酸、生物碱、苯丙素、氰磷酸糖苷、黄酮类化合物、脂肪酸及其衍生物。

图5 在LRDBD中鉴定出的其他化合物的化学结构

2、对LRDBD中不同成分类型的化合物鉴定过程进行推导

通过对CD数据与参考文献的比较，对LRDBD中氨基酸、生物碱类、苯丙素类、糖苷类、黄酮类、脂肪酸及其衍生物、及其他化学成分类型的鉴定过程进行推导说明。质谱图见图6，具体推导鉴定过程如下：

2.1氨基酸

通过对CD数据与参考文献的比较，鉴定出了13个氨基酸。峰27在m/z 182.08127处有一个伪分子离子，在m/z136.07570（[M+H-COOH]+）和m/z119.04934（[M+H-COOH-NH3]+）处产生主要离子。在羧基的中性损失后，m/z 182处的碎片离子在m/z 136处产生了一个碱基峰，表明存在一个羧基。在羧基的中性损失后，m/z 182处的碎片离子在m/z 136处产生了一个碱基峰，表明存在一个羧基，因此，峰27被分配为d-酪氨酸（图6-A）。

图6-A d-酪氨酸质谱图和化合物可能的破碎途径

2.2 生物碱类

在LRDBD中鉴定出36种生物碱，包括哌啶生物碱、季铵盐生物碱、有机胺生物碱、嘌呤生物碱和铟生物碱。通过与参考标准的比较，峰28被明确地指定为腺苷。腺苷的质谱和可能的片段途径如图6-B所示。

图6-B 腺苷质谱图和化合物可能的破碎途径

其余类型化合物推导及图见原文：doi: 10.1016/j.foodres.2022.111852.

3、LRDBD与单一草药的多因素统计分析：复方中存在23种单一草药中没有的新化合物

在使用CD软件对原始数据进行比对和去卷积后，去除QC样品中峰面积变化系数低于30%的背景离子和化合物，用于进一步的PCA主成分和火山图的多元分析。首先，PCA评分图突出了QC样品相对紧密的聚类，证实了样品的色谱分离和质谱分析在整个分析过程中都是稳定的，数据的准确性较好。然而，在LRDBD组和单药草组的PCA评分图中明显分离（图7-A）。

图7-A  从LRDBD和8种单一草药中提取的正、负离子模式下的化合物的PCA评分图

LRDBD和8种单一草药的分析结果被总结在一个维恩图中。如图7-B所示，LRDBD汤剂中存在23种新成分。由于相容性、加热等的影响，以及中药化学成分的复杂性，LRDBD在煎煮过程中由于溶液中化学成分的络合、水解、氧化或还原反应，可能产生新的成分。根据已知化合物，结合保留时间、m/z比和MS/MS片段信息，结合结构推断，从23种新成分中鉴定出9种成分：奎宁酸、原花青素A2、多聚素、氧白藜芦醇、丙豆酸、18β-甘氨酸、2-羟丙基硬脂酸酯、单烯酸和化合物49。

图7-B  维恩图显示了在LRDBD和8种单一草本植物中鉴定出的和重叠的植物化学物质的数量

其他化合物由于缺乏标准无法完全鉴定，数据库中无法检索，需要进一步鉴定。建立并生成了一个火山模型，进一步表征了其显著性差异（图7-C）。P值小于0.001和FC大于3的变量表示与LRDBD中8种单一草药成分不同的化合物。

图7-C  8种不同单一草药在正负离子模式下提取的LRDBD化合物的差异分析

据此，筛选出了39种化合物。总的来说，LRDBD和8种不同的单一草药之间有39种化合物不同。该分析还反映了多种药物的多种成分之间复杂的相互作用，这不同于单一药物。其具体机制有待进一步研究。

4、大鼠血浆中鉴定了LRDBD的原型成分29个和代谢物35个

口服LRDBD 4天后，在不同时间采集大鼠血浆样本。我们将在所有时间点收集的血浆样本混合，以获得用于分析的剂量血浆。空白血浆和LRDBD分别作为阴性对照和阳性对照。提取的色谱峰，出现在给药的血浆中和LRDBD中，而不是空白血浆中，即被确定为吸收的原型成分。根据这一标准，通过将准确的质量和保留时间与LRDBD中识别的成分信息进行比较，来确定LRDBD的可吸收成分。利用CD平台上精确的精确质谱和串联质谱数据进行进一步确认。具体的识别过程如图8所示。

图8 进入血液中吸收的LRDBD成分的成分分析

此外，使用CD软件比较了给药血浆和空白血浆的质谱数据，以鉴定代谢物。在给药的血浆中检测到代谢物，但在空白血浆和LRDBD中没有检测到，并且具有与原型成分相同的离子片段。

4.1 鉴定被血液吸收的原型成分29种

根据提取离子色谱（EIC）函数，与LRDBD成分相比，鉴定出29种原型成分作为给药血浆中的吸收成分（表2）。此外，29个原型成分中有15个原型成分来自鹿茸，这与鹿茸是主要活性成分的SM理论相一致。所吸收的成分与LRDBD中的主要活性物质相对应。我们的研究结果为LRDBD的进一步研究提供了标志性化合物和方法参考。

表2 大鼠血浆中LRDBD的原型入血成分

4.2 35种代谢产物的鉴定

如表3所示，用CD软件对大鼠血浆中16种原型成分转化的35种代谢物进行了分析。主要发生I相代谢反应，如硝基还原、氧化脱氨为醇、去饱和、还原、水化、氧化、脱水、氧化脱氨为酮、去甲基化和II相代谢反应，如乙酰化、甲基化、硫酸化。

表3 大鼠血浆中LRDBD的代谢物

以M19为例，说明代谢物的鉴定过程。M19在m/z 119.08604处有一个前体离子[M+H]+，主要特征产物离子为m/z91.054[M+H−C2H2]+和m/z115.054[M+H−H4] +。M19的前体离子比麻黄碱小47 Da，如图9-A所示，M19的特征片段与麻黄碱相似。根据M19的相关质谱裂解行为，推导是麻黄碱去饱和+硝基还原的代谢物。此外，比较M35与硬脂酰胺的精确分子量，质谱结果表明，m/z57.071[m+H- C15H30NO]+为碎片离子，与硬脂酰胺的碎片离子一致。因此，M35是硬脂酰胺的II相代谢物（图9-B）。其他的代谢物也以类似的方式被鉴定出来。

图9 LRDBD中原型化合物的碎片离子

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研究结论

1、本研究建立了高灵敏度、高分辨率的UHPLC--HRMS法测定LRDBD的物质基础，并将煎煮后的LRDBD与8种单药的成分进行比较。

2、在LRDBD中鉴定出122种化合物，包括氨基酸、苯丙素、生物碱、黄酮、脂肪酸化合物及其衍生物、黄酮类等。这是第一次对LRDBD的化学成分进行了全面的表征。

3、在LRDBD中检测到23种新成分是8种单药中不存在的，可能是煎煮过程中药物之间的化学成分相互作用。此外，统计分析LRDBD和8种单一药草之间有39种化合物不同。这一结果也反映了多种药物的多种成分之间复杂的相互作用，不同于单一药物。

4、大鼠血浆中鉴定出29种LRDBD的原型成分和35种代谢物。去饱和、还原、水化、氧化、脱水、去甲基化、乙酰化、甲基化和硫酸盐化是主要的代谢途径。其中，鹿茸原型成分15种，在血浆中所占比例最大。上述结果与SM理论：鹿茸在哮喘治疗中起主要作用相一致。本研究将有助于对哮喘症状指导网络的药理分析，以及发现潜在的药物靶点，揭示LRDBD在哮喘治疗中的作用机制。

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参考文献：https://doi.org/10.1016/j.foodres.2022.111852