J HEPATOL | IF=25.7 蛋白组学分析无创液体活检，助力胆管癌风险和预后研究！！

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研究背景

胆管癌（CCA）是一种恶性肿瘤，通常在早期难以被确诊，并且其治疗和管理的挑战性很高。液体活检是一种无创、低风险且可重复进行的方法，可以通过血液或其他体液样本中的蛋白标志物来评估胆管癌的风险、进行早期诊断和预测疾病的进展以及预后。细胞外囊泡（EVs）是一种纳米级的脂质分层球体，从细胞中释放出来并存在于生物流体中的囊泡含有不同类型的生物大分子（如蛋白质、核酸、脂质和代谢物），并参与细胞间的交流，是发现生物标志物的有用工具。

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前言

2023年5月31日，西班牙巴斯克大学Ainhoa Lapitz团队在Journal Of Hepatology期刊（IF 25.7）发表题为“Liquid biopsy-based protein biomarkers for risk prediction, early diagnosis, and prognostication of cholangiocarcinoma”的研究成果。文章通过蛋白组学和ELISA等方法分析血液或其他体液中的特定蛋白标志物，对胆管癌进行的风险评估。利用液体活检可以提供非侵入性的诊断方法，有助于早期发现和治疗胆管癌，并预测疾病的进展和预后。

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研究思路

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研究方法

研究材料

1）PSC患者血清（原发性硬化性胆管炎，n=45）；

2）PSC-CCA患者血清（伴发原发性硬化性胆管炎的胆管癌，n=44）；

3）PSC to CCA患者血清（随访过程发生CCA的PSC，n=25）；

4）CCA患者血清（非PSC病因的CCA，n=56）

5）HCC患者血清（肝细胞癌，n=34）

6）Healthy血清（健康个体，n=56）

研究技术

1）蛋白组学；

2）ELISA；

3）纳米颗粒跟踪分析；

4）免疫印迹；

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研究结果

1、PSC-CCA患者、PSC患者和健康个体中EV蛋白的差异丰度揭示了诊断CCA的候选生物标志物

作者使用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和免疫印迹等方法对PSC-CCA患者、PSC患者和健康人群分离的血清中EVs进行了表征。结果显示，TEM图像证实囊泡平均尺寸小于200 nm（图1A）。NTA分析揭示EV分离的主要组分是外泌体和中小型微囊泡（图1B）。免疫印迹结果证实了获得的EV组分分离得当且纯度较高（图1C）。对EV进行蛋白组学分析（Orbitrap MS），发现各组蛋白组成各不相同。随后，研究了单个候选生物标志物的诊断能力，47种EV蛋白在CCA诊断中显示出显著的AUC值，与PSC（AUC = 0.909）或非恶性对照组（AUC = 0.931）相比，FRIL得分最高（图1D，E）。

图1 分离的血清EV组分富集在外泌体和微囊泡中

并含有对PSC - CCA具有诊断能力的蛋白

2、血清EVs含有用于CCAs早期、准确和基于病因学诊断的蛋白质生物标志物

为了测试这些候选的CCA生物标志物是否专门适用于PSC患者，作者使用了一种新型且更强大的质谱仪（timsTOF cohort），对之前的样本以及来自PSC患者、PSC-CCA患者、non-PSC CCA患者和健康个体的新样本进行了分析。有五种蛋白能够明确区分PSC-CCA患者和PSC患者，其中LG3BP、IGLL5和IGKC的诊断能力最高（AUC分别为0.710、0.687和0.654）（图2A）。有7种蛋白能够直接诊断non-PSC CCA，与健康状况相比，其AUC值可高达0.854（TSN9为最高）（图2B）。与非恶性对照组相比，Pan-CCA组63种EV蛋白的丰度发生了变化（图2C）。其中，FIBG、HEMO和PON1是最佳个体诊断生物标志物，其AUC值分别为0.823、0.795和0.777。

图2根据肿瘤病因诊断CCA的血清EV蛋白生物标记物

3、通过免疫印迹和ELISA检测总血清中的pan-CCA EV生物标志物，辅助诊断

随后，研究发现，Pan-CCA EV 生物标志物不仅可以在血清EV中检测到，还可以在总血清中检测到。大多数分析的蛋白质在分离的EV中富集，但在全血清中也可检测到（如VWF，PIGR，FIBG，FIBB，FGL1，CRP，FRIL和OIT3，图3）。为了确定这些生物标志物在临床中的潜在应用，作者使用ELISA证明总血清中这些生物标志物的水平与血清EV中测量的水平相关。与健康个体相比，CCA患者的多种生物标志物水平升高，这些升高的水平可以准确诊断pan-CCA。某些生物标志物水平的升高也与PSC患者的CCA风险较高相关。总体而言，这些生物标志物在CCA的诊断和PSC患者的早期检测有很大的应用价值。

图3 利用总血清检测候选EV蛋白生物标志物并辅助CCA的诊断

CCA候选生物标志物的水平与CCA亚型或疾病状态无关。然而，与iCCA患者相比，pCCA或dCCA患者的PIGR水平较高。患有转移性疾病的患者FGL1水平升高，而在疾病较晚期的患者FGL1水平仍然升高。VWF、FIBRINOGEN和OIT3的水平与血清CA19-9水平呈正相关，而肝硬化的存在并不影响生物标志物水平。随后作者基于机器学习的逻辑模型结合不同的生物标志物用于增强CCA和PSC-CCA的诊断能力。该模型在识别CCA方面表现出很高的准确性，无论其病因如何，在存在PSC时准确诊断PSC-CCA，并在不存在 PSC 的情况下为 CCA 提供最大的诊断能力。这些模型的表现优于单个生物标志物，并提高了单独 CA19-9 的诊断能力。

图4 LMs联合ELISA验证的血清蛋白生物标志物

能够准确诊断有或无PSC的CCA患者

4、血清Pan-CCA生物标志物有助于iCCA与HCC的鉴别诊断

该研究发现，通过ELISA测量的FGL1、CRP、PIGR、FIBRINOGEN、VWF、FRIL和OIT3的血清水平在iCCA患者中显著增高。值得注意的是，FGL1和CRP的血清水平增高与iCCA存在的风险最高相关，而这两个生物标志物的组合使风险增加至144（图5 A）。

为了找出更多用于鉴别诊断iCCA和HCC的生物标记物，作者评估了HCC、iCCA和PSC患者以及健康人群的血清EV的蛋白质组学特征。获得了13个特定的iCCA候选生物标志物，其中APOC3、ALBU和AMPN的AUC值最高（分别为0.736、0.732和0.726；图5 B）。同样鉴定了58个HCC特异性EV蛋白质生物标志物，其中30个在HCC患者的血清EV中丰度增加，与iCCA患者和健康人群相比，而28个显示出降低水平（图5 C）。其中，ANGP1在区分HCC和iCCA患者方面具有最高的诊断能力（AUC=0.850）。

图5用于鉴别诊断iCCA与HCC的血清EV蛋白生物标记物

5、EV 蛋白质生物标记物主要在肝脏中表达，并在特定细胞群中有所不同

通过对人类多器官转录组数据集的分析，作者解析了候选血清EV蛋白生物标志物在CCA中的潜在来源（图6 A）。数据显示，所有这些EV蛋白生物标志物在肝胆组织中均有表达。有趣的是，包括FGA、FGG、FGB、CRP、FGL1和OIT3在内的一些EV生物标志物几乎仅在肝胆组织中表达，并占据了人体器官中总表达量的70%以上。人类肝脏单细胞RNA测序结果显示，一些候选标志物的表达具有细胞类型特异性（图6 B）。例如，PIGR几乎专门在胆管细胞中表达，而内皮细胞中OIT3和VWF的表达最高。此外，FGA、FGG、FGB、CRP和FGL1的主要来源是肝细胞，而FTL的表达更加多样。

图6 人类多器官转录组和scRNA-seq揭示血清EV蛋白生物标记物的潜在来源

6、ScRNA-seq数据揭示了人类CCA肿瘤中表达EV蛋白生物标记物的特定细胞类型

随后作者研究了上述pan-CCA生物标记物在人类CCA肿瘤细胞群中的表达情况（图6 C）。GSE151530和GSE125449数据集分别由12名和10名患者的CCA肿瘤样本组成，在分析这两个数据集的单细胞转录组时发现，表达FGA、FGG、FGB、CRP、FGL1和PIGR的细胞中，恶性胆管细胞的比例最高，而表达VWF和OIT3的细胞主要是内皮细胞，FTL在所有主要肿瘤细胞中都能检测到。作者随后通过免疫荧光验证了这些发现，在人类 PSC-CCA 和non-PSC CCA 组织中都能强烈检测到 PIGR、FIBG、CRP 和 FGL1，它们大多与CK19 +共定位，从而证实了它们特异性地表达于肿瘤内的恶性胆管细胞，而与疾病的病因无关（图6 D）。

7、在出现恶性肿瘤的临床证据之前，血清EV蛋白可预测PSC患者的CCA发展情况

考虑到OIT3、PIGR、FRIL、CRP和FIBG可能对PSC患者的CCA发展具有预测价值，接下来通过ELISA分析了它们的血清水平。虽然OIT3没有观察到差异，但与非恶性PSC患者相比FIBRINOGEN、CRP、PIGR和FRIL的水平在PSC to CCA组的血清增加。此外，这些生物标志物的血清水平与已确认的PSC-CCA患者的水平相似。在个体水平上，将四个候选血清生物标志物与CA19-9、总胆红素、门冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）和碱性磷酸酶（ALP）进行预测力比较，发现FIBRINOGEN显著优于其他（除了胆红素）。CRP、FRIL和PIGR显著优于AST、ALT和GGT（图7 B）。重要的是，所有在这四个预测性生物标志物中表现出较高水平的PSC患者在随访期间都发展为CCA，而没有这些生物标志物升高的患者则不发展为CCA。逻辑回归模型显示，与非恶性PSC患者相比，CRP、FIBRINOGEN和FRIL水平增加的PSC患者在随访期间发展CCA的风险增加了44倍。相比之下，PSC患者血清CA19-9水平的增加并不代表发展CCA的风险更大（图7 C）。

图7 通过血清蛋白可预测PSC患者的CCA发展情况

8、血清中EV蛋白可预测CCA患者的预后 

最后，包含三个“不良预后生物标志物”（COMP、GNAI2和CFAI）的组合显示出最佳的生存期（OS）预测能力（图8 C）。这些生物标志物均未升高的患者的中位OS为102个月。相反，这些生物标志物中有两种到三种水平较高与更短的患者的中位OS为5个月。令人惊讶的是，与这三种蛋白质水平较低的患者相比，这些患者的死亡风险增加了30倍。类似地，在CCA患者中，包含三个“良好预后生物标志物”（ACTN1、MYCT1和PF4V）的组合对CCA患者的OS预测效果最好。血清中这三个生物标志物水平升高的患者示出102个月的中位OS，而当至少其中一个血清EV蛋白质水平较低时，中位OS仅为9个月，并伴有6倍的死亡风险增加。

图8 血清EV蛋白水平与患者预后的关系

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研究结论

通过蛋白组学、单细胞转录组学等研究方法，研究人员解析了不同疾病患者的血清EVs，证明了血清EVs中含有蛋白质生物标记物，可用于预测PSC to CCA的发展，也可用于早期检测PSC患者、non PSC患者和CCA患者。这将为CCA的早期无创诊断开辟一条新途径，从而能够及时进行治疗干预，改善患者的福利和预后。

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参考：10.1016/j.jhep.2023.02.027