BAM（IF=16.874）| 外泌体蛋白质组探究壳聚糖寡糖促进外周轴突再生机制

2023年3月，江苏省南通大学在Bioactive Materials发表的题为 “Fibroblast exosomal TFAP2C induced by chitosan oligosaccharides promotes peripheral axon regeneration via the miR-132-5p/CAMKK1 axis”（IF：16.874）的研究成果，通过iTRAQ蛋白组研究方法，检测了受伤后坐骨神经中的蛋白质表达谱，揭示了COS在轴突再生中的机制，为再生医学中的临床应用提供了理论依据。    

中文标题：壳聚糖寡糖诱导的成纤维细胞外泌体TFAP2C通过miR-132-5p/CAMKK1轴促进外周轴突再生

研究对象：大鼠坐骨神经，外泌体

发表期刊：Bioactive Materials

影响因子：16.874

发表时间：2023年3月9日

运用生物技术：iTRAQ蛋白组

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研究背景

与中枢神经系统（CNS）中的轴突再生不同，周围神经系统（PNS）中的轴突再生相对容易且可实现，但是PNS的长距离缺陷仍然是临床的一个挑战。自体神经植入术效果最好，但是，有限的来源和供体部位的永久性损伤严重阻碍了这项技术的广泛应用。

壳聚糖是一种天然来源的多糖，具有出色的生物相容性、生物降解和抗菌特性。壳聚糖及其衍生物被广泛用于各种领域，如食品加工、水处理、化妆品和织物。有研究表明，以壳聚糖为基础的神经移植物在大鼠、狗和猴子的周围神经再生中取得了巨大的成功，壳聚糖构建的神经支架在临床试验中表现出优异的性能。除了作为连接损伤神经的管道外，支架降解产物壳聚糖（COS）对周围神经再生至关重要。轴突再生是周围神经再生的关键，然而，周围神经中的COS和轴突再生尚未得到充分研究。作者进行了一系列实验来确定COS对周围神经轴突生长和再生的影响。

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研究思路

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研究结果

为了揭示壳聚糖降解产物促进损伤后周围神经再生潜在的机制，构建了大鼠坐骨神经中10 mm缺陷，并用填充COS的硅胶管桥接。在术后6h、12h、1d、4d和7d收获坐骨神经，使用iTRAQ进行蛋白组学分析，鉴定到2049个蛋白。COS在所有时间点诱导了337个上调蛋白和228个下调蛋白（图1b）。细胞成分分析表明这些差异表达的蛋白与囊泡形成、转运、出芽或内吞作用密切相关（图1c）。热图显示，外泌体相关蛋白在早期增加，其他簇也和神经再生相关（图1d），这些数据揭示外泌体相关的生物学过程参与了COS诱导的损伤后周围神经再生的改善。为了确定有助于外泌体分泌的细胞，使用免疫荧光分析对一些标志物蛋白进行了检测（图1e），结果发现外泌体主要来源于成纤维细胞（f-EXO），它们负责COS诱导的损伤后坐骨神经再生。

 图1 | 成纤维细胞衍生的外泌体参与COS诱导的轴突伸长

如图2e所示，来自COS处理的成纤维细胞的f-EXO和EXO显著促进了神经突的生长。值得注意的是，与f-EXO相比，COS-f-EXO进一步加强了神经突的生长（图2e和f）。在0~14×109外泌体颗粒/ml范围内，这种促进以剂量依赖的方式发生，然后，对神经突生长的促进趋于稳定（图2g和h）。此外，COS处理增加了原代成纤维细胞的细胞活力和增殖。

 图2 | COS处理的成纤维细胞的外泌体促进神经突生长

为了评估COS-f-EXO对体内轴突生长的潜在影响，用填充有f-EXO或COS-f-EXO的硅胶管桥接大鼠坐骨神经10 mm长的缺陷。与对照组相比，f-EXOs，特别是COS-f-EXO在术后第14天促进截肢轴突伸长（图3a和b）。行走轨迹分析结果显示，与未受伤的右后爪相比，损伤后左后爪的强度和接触面积均显著降低（图3c），f-EXO和COS-f-EXO的应用在强度和接触面积方面减弱了这些降低（图3d和e）。值得注意的是，与f-EXO相比，COS-f-EXO在轴突再生和步行轨迹分析方面表现出更好的性能。

图3 | COS处理的成纤维细胞的外泌体促进

坐骨神经损伤大鼠的轴突再生和功能恢复

对外泌体蛋白进行质谱分析，总共检测到673种蛋白质，其中237个是差异蛋白。功能注释表明，这些上调蛋白与轴突生长密切相关，神经元投射、轴突和神经丝模块证明了这一点（图4a）。作者将重点放在TFAP2C蛋白上，因为它是一种主要的转录因子。生物信息学分析结果显示，TFAP2C可能参与轴突细胞质、轴突引导和发育以及神经丝（图4c），表明TFAP2C可能是促进轴突再生的有力候选者。

 图4 | 外泌体蛋白鉴定

为了验证以上预测，使用电穿孔方式转染表达Tfap2c的质粒进入DRG神经元，发现这种处理明显诱导神经突生长（图5a）。而使用siRNA下调Tfap2c表达，很大程度上抑制了神经突生长（图5d）。作者改变了TFAP2C在成纤维细胞中的表达来改变其在EXO中的表达。如图5e所示，在转染TFAP2C质粒的成纤维细胞的外泌体中TFAP2C增加。正如预期的那样，神经突的生长得到了增强（图5f）。此外，从转染siRNA的成纤维细胞中制备了TFAP2C缺陷EXO，处理DRG神经元减少了神经突生长（图5h）。

图5 | TFAP2C是神经突生长的正调节因子

接下来，作者研究了TFAP2C在神经突生长中的下游效应子。构建了四个质粒来检查TFAP2C是否影响pri-miRNA-132的表达。Pri-miRNA-132基因包含miR-132-3p和miR-132-5p两种产物，检测了上述两种miRNA在培养DRG中的表达谱。结果显示，miR-132-5p是DRG神经元中的主要亚型（图6c），因此，选择miR-132-5p进行进一步分析。用表达TFAP2C的质粒转染培养的DRG神经元，miR-132-5p的表达明显降低（图6d）。接下来，检测了miR-132-5p是否影响轴突生长。使用miR-132-5p模拟物或抑制剂转染培养的DRG神经元。如图6e所示，miR-132-5p模拟物抑制了神经突生长。相反，miR-132-5p抑制剂刺激神经突生长（图6f）。这些数据表明，TFAP2C靶向并抑制DRG神经元中的miR-132-5p，以促进神经突的生长。

 图6 | TFAP2C靶向miR-132-5p来调节神经突的生长

大多数情况下，miRNA通过抑制其靶基因来执行其生物学功能。Camkk1的同系物Camkk2已被证明对小脑颗粒细胞的发育有显著贡献，这表明Camkk1可能参与神经发生，如神经突延伸。在培养的DRG神经元中，发现miR-132-5p模拟物抑制了Camkk1的表达，而miR-132-5p抑制剂在mRNA和蛋白质水平上增强了Camkk1的表达（图7b和c）。接下来研究CAMKK1对神经突生长的影响。在培养的DRG神经元中转染CAMKK1可显著增加神经突长度（图7d）；Camkk1 siRNA-2和-3减少了神经突的长度，但siRNA-1没有减少（图7g）。miR-132-5p抑制剂增加的神经突生长可以通过敲低Camkk1来减少（图7h）。这些数据表明，miR-132-5p靶向下调Camkk1以阻止DRG神经元的神经突生长。

图7 | Camkk1是miR-132-5p的底物

使用了具有10毫米长的坐骨神经缺陷的大鼠模型来研究miR-132-5p对轴突生长在体内的影响。用硅胶管桥接缺陷，其中注入miR-132-5p miRNA拮抗剂（antagomir）或阴性对照。在antagomir处理组，miR-132-5p下调（图8a），而CAMKK1表达增加（图8b和c）。免疫荧光数据显示，antagomir可促进坐骨神经轴突再生（图8d）。步行轨迹分析和电生理分析等结果表明miR-132-5p/CAMKK1轴在损伤后的轴突再生中起关键作用。

 图8 | 抑制miR-132-5p促进损伤后坐骨神经功能恢复

miR-132-5p的表达受到COS-f-EXO的抑制，而CAMKK1被促进（图9a-c）。Akt通路是CAMKK1的下游靶点，它的激活被认为是生长的积极信号。分析了这一途径，发现COS-f-EXOs增强了磷酸化的Akt（p-Akt）（图9c-e）。

 图9 | f-EXO和COS-f-EXO对miR-132-5p和CAMKK1在体内表达的影响

04

研究结论

总的来说，本篇文章的数据揭示了COS促进轴突再生的潜在机制，即COS靶向坐骨神经中的成纤维细胞，并诱导富含TFAP2C的外泌体分泌，从而将TFAP2C转移到受体轴突中。TFAP2C下调miR-132-5p以减轻其对CAMKK1的抑制，引起CAMKK1上调。CAMKK1的表达增加促进神经突生长，从而促进周围神经的轴突再生，这些数据通过定义轴突再生和成纤维细胞之间的关系提供了轴突再生的见解。该文章数据也为壳聚糖生物材料在再生医学中的临床应用提供了理论依据。

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该文章通过iTRAQ蛋白组技术，检测术后不同时间点大鼠坐骨神经缺陷模型的坐骨神经进行检测，发现了外泌体相关的生物事件在壳聚糖降解产物（如COS）促进损伤后周围神经再生起关键作用。通过对外泌体蛋白进行检测，发现TFAP2C可能是促进轴突再生的有力候选者，结合电击转染和免疫荧光分析等技术，找到了壳聚糖生物材料促进轴突再生的机制。

参考文献

DOI:10.1016/j.bioactmat.2023.03.002.

上海鹿明生物科技有限公司多年来，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组学和代谢组学为基础的多层组学整合实验与分析的团队。目前在多层组学研究已经有了成熟的技术方法，欢迎各位老师前来咨询哦~

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Lemon 撰文

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本文系鹿明生物原创解读

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