外泌体是什么？外泌体(Exosome)研究的正确打开方式

外泌体（Exosome）是细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV）的一种，是由脂质双分子层包裹的微小囊泡，直径一般为30-150 nm。外泌体的膜主要由脂质和蛋白质组成，其内容物中除蛋白质外还发现了多种核酸，包括DNA、mRNA、microRNA和ncRNA等。

外泌体可以由所有细胞类型分泌,包括免疫细胞、神经元细胞、上皮细胞、内皮细胞、胚胎细胞、癌细胞和间充质干细胞等，广泛分布于血液、尿液、唾液、乳汁、胆汁等各种体液中。

外泌体结构示意图

外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。外泌体的分离方法通常包括差速离心、密度梯度离心、超滤离心、磁珠免疫法、聚合物沉淀以及试剂盒等方法。

1、 超速离心法（差速离心）

超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。

图1 差速离心法

2、 密度梯度离心法

在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集。此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。

图2 密度梯度离心

3、 超滤离心法

由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法，但同样存在纯度不高的问题。

4、 磁珠免疫法

外泌体表面有其特异性标记物，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。

图3 磁珠免疫法

5、 PEG-base沉淀法

聚乙二醇（PEG）可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。

6、 试剂盒提取法

近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将外泌体沉淀出来。

图4 色谱法

1、电镜检测

透射电子显微镜观察法（TEM）是从形态和大小上对外泌体进行鉴定。通过负染的方法，在高倍放大下直接观察单个外泌体的形态结构和大小。

2、粒径检测

粒径分析是从整体上对外泌体大小的分布情况进行检测，具有准确、快速、重复性好等优点，是对现有外泌体鉴定方法的良好补充。

3、Western Blot检测

Western blot是通过抗原抗体特异性结合的原理，对外泌体标志蛋白进行检测，从蛋白质层面对外泌体进行鉴定。常用的外泌体标志蛋白包括CD63、TSG101及Alix等。

图5 外泌体鉴定常用方法

外泌体能够将核酸、蛋白质和脂质在内的多种生物活性分子从供体细胞转移到受体细胞，介导细胞间通讯和分子转运；并且外泌体可以由所有类型的活细胞分泌，在体液中广泛分布。因此外泌体在生理病理标志物和药物递送方面有巨大的应用潜力。

1.外泌体作为肿瘤液体活检的新前沿

癌症是全世界人口死亡的主要原因之一。相比于传统的组织活检，液体活检侵入性极小、样本易收集，逐渐成为癌症诊断和预后预测的新策略。

外泌体携带的内容物不仅能够反映亲本细胞的生理病理特征；它还具有脂质双分子层的稳定结构，即使在恶劣的肿瘤微环境下也能够稳定循环；而且体液中包含大量外泌体。因此外泌体成为液体活检中最具潜力的新型生物标志物[1][2][3]。

2. 外泌体作为无细胞治疗的新兴方案

外泌体作为一种天然的纳米级别运输囊泡，它还具备细胞以及人工合成囊泡（脂质体等）所不具备的一些优良特性，比如说低免疫原性、高耐受性、高通透性、可靶向改造、易获得等[4][5]。因此其在疾病治疗中应用潜能也吸引了人们的关注。