mSystems | 16S+代谢:多组学联合分析指导生产应用：人工窖泥培养技术及白酒质量优化

浓香型白酒（SFB）在窖泥窖内发酵过程中，获得了其特有的风味。窖泥中的微生物是产生风味酯的关键前提物。本篇为欧易/鹿明生物合作客户四川省农业科学院水稻高粱研究所（一作：刘茂柯）于2020年3月在微生物学专刊《mSystems》（IF=6.469）发表的题为“Structural and Functional Changes in Prokaryotic Communities in Artificial Pit Mud during Chinese Baijiu Production”的研究报道，该研究对酿造微生态系统进行了首次16S rRNA测序，蛋白质组学和代谢组学联合分析。运用多组学方法能够更全面地了解高质量浓香白酒生产过程中人工窖泥微生物群落发生的代谢过程变化，这将有助于进一步优化人工窖泥培养技术和改善浓香白酒的质量。

通过固态发酵生产的中国烈酒浓香白酒是世界上最古老的馏出物之一，年产量为910万吨。浓香白酒包含己酸乙酯，丁酸乙酯，乳酸乙酯和乙酸乙酯等多种风味酯。根据己酸乙酯的含量，可以将浓香白酒质量分为不同等级。增加己酸乙酯与乳酸乙酯的比例可以提高浓香白酒的质量。浓香白酒发酵的主要谷物是高粱，其发酵涉及源自泥浆的多种微生物和一种称为大曲的糖化发酵剂。

矿坑窖泥中的微生物会产生各种小分子有机酸（例如己酸，丁酸，乙酸和乳酸），它们是风味酯的关键前提物，这在很大程度上决定了浓香白酒的质量。由于在成熟窖泥中有特殊的微生物群落，因此只能使用成熟的窖泥来酿造高质量的浓香白酒。但是泥浆的自然成熟期超过20年，这严重限制了高质量浓香白酒的生产。自1960年代以来，基于对天然窖泥微生物学的了解，人们开始生产人工窖泥以提高高质量浓香白酒的产量。

通常，人工窖泥的制备方法是将发酵剂接种到新鲜土壤、天然成熟的窖泥、小麦和豆粕的混合物中，然后在厌氧条件下孵育30至60天。当前已有多种可培养和免培养方法研究过人工窖泥中的微生物群落，然而我们对人工窖泥中微生物动力学和相关功能变异的分子机制以及这种变异在高质量浓香白酒生产中作用的了解仍然有限。

1.人工窖泥理化性质

作者从浓香白酒酿造的初始状态以及前四个酿造批次结束时对人工窖泥进行采样，每批次的酿造时间为90天。对其理化性质分析发现，人工窖泥成熟过程中样品的腐殖质和有效磷含量分别增加41.84％和200.00％（P< 0.05）（表1）。随着时间的推移，水分、有机物、pH、总氮、总磷、总钾、NH4+和有效钾含量保持相似。

表1 |浓香白酒酿造过程中人工窖泥样品的理化和原核生物群落特性

2.浓香白酒风味化合物

在浓香白酒样品中总共检测到31种风味化合物：12种酯，8种醇，6种酸，3种醛和2种酮。主要风味化合物包括己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、1-丙醇、3-甲基丁醇、正己醇、2-丁醇、乙酸、丁酸、己酸、异戊酸和乙醛二乙缩醛。这13种风味物质占样品中风味物质的95.73%（图1a）。酿造过程中己酸乙酯和丁酸乙酯的含量增加（P <0.05），且分别在第四批和第三批浓香白酒样品中达到最高水平。从第一批到第二批，乙酸乙酯含量显着下降（P <0.05）（图1b）。己酸乙酯/乳酸乙酯的比率从0.81稳定增加到2.77（P <0.05），表明浓香白酒的质量有所提高（图1c）。

图1 | 浓香白酒酿造过程中风味化合物动力学

3.16S rRNA基因的扩增子测序和qPCR

主成分分析（PCA）中，原核生物群落显示出批次依赖性的聚类（图2a）。OTU分为36个原核生物类别。在至少一个人工窖泥成熟阶段，最丰富的9种类别分别是芽孢杆菌、梭状芽胞杆菌、结肠杆菌、放线菌、Negativicutes、γ-变形细菌、Alpha变形细菌、Bacteroidia和Synergistia(图2b)。使用qPCR对最丰富的OTU（梭状芽胞杆菌和乳杆菌）进行了定量，梭状芽孢杆菌的浓度在第一批次中显著下降，随后逐渐提升。而乳杆菌浓度在第一批次中显示上升，随后在第二批次中下降（图2c）。

图2 | 人工窖泥样品中原核生物的16S rRNA基因分析

4.原核生物群落与理化性质和浓香白酒主要风味物质的关系

人工窖泥理化特性与最丰富的原核属之间的Pearson相关分析表明，总氮，有效磷和有效钾与15个属相关（图3a）。在15个属中，有6个属与浓香白酒样品中的8种以上主要风味化合物相关（图3b）。

图3 | 主要原核属与理化特性之间的皮尔逊相关系数

5.人工窖泥原核生物群落的蛋白质组学分析

接下来，作者为了更深入地了解功能变化及其与浓香白酒质量的关系，对第一批和第四批人工窖泥样品进行了蛋白质组学和代谢组学分析。通过TMT蛋白质组学方法共鉴定到213种原核蛋白，三个最丰富的类占原核蛋白的78.39%（图4a）。Negativicutes（32.39%）是最丰富的类，其次是Clostridia（23.00%）和Bacilli（23.00%）。鉴定到的蛋白质来自于70个属，其中乳杆菌有18.31%，梭菌有9.86%，孢子虫有5.16%（图4b）。共鉴定到来自24个属的47种差异蛋白，这些差异蛋白主要属于乳酸杆菌（图4c）。差异蛋白的GO分析发现最大的变化发生在代谢过程中，包括ADP代谢过程，嘌呤核糖核苷二磷酸代谢过程和嘌呤核苷二磷酸代谢过程（图4d）。

图4 | 第一批和第四批人工窖泥样品中原核生物群落的宏蛋白质组学分析

6.人工窖泥的代谢组学分析

非靶向代谢组学分析共鉴定出7,478种代谢物。GC-MS代谢组学和LC-MS代谢组学方法在OPLS-DA中均可明确分离批次（图5a至d）。在第四批人工窖泥样品中，分别上调和下调了491和523种代谢物。差异代谢产物被分为16个功能类别（图5f）。脂质和类脂质分子（38.07%）最多，其次是有机杂环化合物（16.17%）和有机酸及其衍生物（13.11%）。

图5 |  第一批和第四批人工窖泥样品的代谢组学分析

7.浓香白酒中决定风味酯的关键物质合成相关的代谢途径

在浓香白酒决定风味酯的关键物质中，第四批人工窖泥样品中的己酸含量高于第一批人工窖泥样品（P <0.05），而丁酸和乳酸含量降低（P< 0.05）（图5g）。基于KEGG富集分析，确定了产生己酸，丁酸和乳酸的代谢途径（图6）。在多种途径中，丁酸代谢和丙酮酸代谢途径直接参与己酸，丁酸和乳酸的产生。

图6 | 人工窖泥样品中己酸，丁酸和乳酸合成有关的途径，蛋白质，代谢物和物种的示意图

这项多层组学研究鉴定了在人工窖泥成熟过程中显着改变的分类群特异性功能和代谢途径。结果揭示了原核生物群落中的几个成员与人工窖泥中的代谢产物和蛋白质之间的关键联系。这些候选微生物、蛋白质和代谢物可能成为预测人工窖泥质量及其发酵状态的靶标，这将有助于进一步优化人工窖泥的培养技术并提高浓香白酒的质量。

浓香白酒占中国白酒总产量的70%以上。自1960年代以来，在中国白酒酿造行业中，人工窖泥被广泛用于建造发酵窖以生产高质量的浓香白酒。为了深入了解人工窖泥原核生物分类和功能动力学机制，以及这种变化与生产高质量浓香白酒之间的联系，本文对该酿造微生态系统进行了首次进行了16S rRNA测序，蛋白质组学和代谢组学联合分析。多组学方法能够更全面地了解高质量浓香白酒生产过程中人工窖泥微生物群落发生的代谢过程变化，这将有助于进一步优化人工窖泥培养技术和改善浓香白酒的质量。

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