Microbiome | 聚焦动物菌群高分研究，益生菌及合生制剂如何影响虹鳟鱼的肠道菌群及代谢组？

2022-06-12 10:27:24, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

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前言

在饲料中添加益生菌和合生制剂改变了虹鳟鱼的肠道菌群，了解饲料类型和不同的生物添加剂如何塑造肠道微生物群，以及宿主和细菌之间的生物相互作用，对于持续提高动物生产的可持续性至关重要。

2022年1月，哥本哈根大学Jacob Agerbo Rasmussen研究员及其课题组在《Microbiome》(IF:14.650)期刊发表了题为“A multi-omics approach unravels metagenomic and metabolic alterations of a probiotic and synbiotic additive in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”的研究成果，通过将肠道内容物样本的多组学研究及数据分析（包括16S rRNA、宏基因组和非靶向代谢组学）进行互补与整合，研究细菌宏基因组组装基因组(MAGs)及其与宿主代谢的分子相互作用。

研究背景

益生菌和益生元通常被认为可以通过减少肠道病原体的流行、改变生长相关的菌群代谢物的合成来促进肠道健康和鱼的生长。尽管已证明与益生菌相关的乳酸菌、片球菌和亮念珠菌存在于鲑鱼的肠道微生物群中，但在鱼肠道环境中运用肠道免疫反应调节的功能知之甚少。因此，作者通过挖掘与鱼相关的肠道微生物群功能来更好地研究鱼生长性能的相关机制。

研究思路

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实验方法

1.研究材料：虹鳟鱼鱼卵

2.饲料性能分析

3.16S rRNA基因测序分析

4.宏基因组研究及宏基因组生物信息学：筛选、组装、装箱、翻新和功能分析

5.代谢组学研究及注释和代谢物亚结构分析

6.细菌相关代谢物的代谢组学网络分析和亚结构分析

研究结果

饲料添加剂和养分利用

根据三个饲养组中虹鳟鱼的体积、重量和数量来评估其饲料性能。通过记录每个贮箱饲料的登记，以及近红外光谱测定的各饲料组的蛋白质和脂质含量发现幼年虹鳟鱼的营养相关表型，如脂质和蛋白质代谢，可以通过功能性饮食来影响。研究分析显示喂养组间的体重增加(WG)、饲料转化比(FCR)和FCR的倒数，饲料优势比(FER)没有显著的差异（图1A、B）。脂质利用比(LER)表明，PRO组的饲料脂质显著转化为生物量(F（2,12）=9.84，p=0.0029)(图1c)，表明该组饲料的使用提高了脂质利用效率。蛋白质浓度比(PER)分析显示，CTRL组的效率明显高于其他喂养类型(F（2,12）=9.88，p=0.0029)1D)。

图1 | 喂养试验的性能试验

Pro添加剂和共生添加剂与整个虹鳟鱼肠道中支原体相对丰度的减少有关

通过比较不同的饮食组中16S rRNA基因分析探究整个肠道微生物组成变化，发现不同组菌群分布有明显变化。CTRL组主要由支原体组成，其他两组中Massilla及 endosym biont8占较高比例（图2a）。主坐标分析(PCoA)显示，96.4%的微生物区系变异可由两个主成分解释，CTRL组的微生物区系单独聚集，而PRO和SYN的微生物区系聚集在一起(图2b)。多样性分析显示丰度并不受肠道部分和饲料影响(图2c)。与CTRL组相比，特别是对于高度丰富的物种(图2e)，PRO和SYN组有更高的微生物多样性(图2d)。

对前50个最丰富的asv进行周向丰度分析，CTRL组支原体丰度显著升高，表明饲料添加剂可能对支原体和双歧杆菌的存在有抑制作用(图2f)。另一方面，与CTRL相比，PRO和SYN中变形菌门、梭状芽孢杆菌科、假单胞菌、马氏菌、葡萄球菌等属均有所增加(图2f)。

图2 | 肠道微生物群的喂养类型和肠道切片的16SrRNA基因分析

支原体的丰度与已知的与鲑鱼代谢相关的微生物途径相关

对宏基因组数据分析，虹鳟鱼宏基因组的研究具有足够的测序深度(图3a)。利用同源基因聚类(COGs)对orf进行注释。比较不同摄食类型中COGs的平均基因覆盖率，发现CTRL组与包括添加剂(PRO组和SYN组)在内的摄食类型之间存在明显的差异，其中CTRL组在大多数类别中COGs的覆盖率最高(图3b)。

此外，对样品和喂养类型之间的COGs组成的调查显示，4个CTRL样品之间具有很高的相似性。TeCTRL样本聚集在远离PRO和SYN之外，除了一个SYN样本(图3c)。对SCG结果的分析显示，6个SCG的密度最高，表明在虹鳟鱼的宏基因组中存在小于6个不同的细菌基因组(图3d)。

图3 | 不同喂养类型的宏基因组变异

用Westernblot和逆转录定量PCR验证相对和绝对定量数据

在PRO和SYN组中，乳酸菌和肠杆菌科的相对丰度都较高，支原体生物量减少(图4a)。在不同喂养组间宏基因组的功能潜力也有显著差异。宏基因组数据的周向丰度分析显示，总共5574个非冗余基因中有670个在CTRL中显著升高，并且发现来自非甲戊酸(MEP)途径的萜类主干合成编码基因在CTRL组中富集，包括ispE、ispF、ispG和ispH(图4a，b)。

图4 | 来自不同喂养类型和肠道切片的肠道微生物组的基因组解析

饮食和支原体的丰富与虹鳟鱼的肠道代谢有关

随后进行全谱代谢组学研究，作者运用UHPLC-MS/MS检索出7190种代谢物（56.59%）。在9723种代谢物中，有741种代谢物被纳入研究。总体代谢变化显示CTRL、PRO和SYN组之间存在明显差异(图5a)。CTRL和其他两种饲料类型之间代谢物亚类组成有明显的差异，包括氨基酸、肽、萜类、胆汁酸、醇和衍生物（图5b-d）。对240种已知代谢物进行分析，得到25种不同丰度的代谢物，而其中19种代谢物在CTRL中更为丰富(图5e)。

图5 | 不同喂养类型的代谢组学分析

与肠道菌群相关的代谢物研究

为研究特异性代谢物与微生物之间的关系，作者计算了每个样本中asv的相对丰度与代谢物子集的浓度之间的相关性。作者对26个样本进行包括16SrRNA基因测序和代谢组学分析。通过对350种代谢物进行网络分析发现：前25个微生物相关代谢物(BAMs)及其相关分子家族。此外，作者在脂肪酸酰基分子家族中发现了BAMs，表明SCFAs间的关系。含有BAMs的推测网络图显示，代谢物之间有三个亚结构基序，包括组氨酸、烷基胺和肌酐，表明虹鳟鱼的肠道细菌将氨衍生为肽（图6）。这些研究可能符合作者对精氨酸生物合成的宏基因组观察，包括富含氨的多肽代谢。

图6 | 细菌相关代谢物及其分子家族的分子网络

研究结论

1.饲料添加剂改变了微生物群，虹鳟鱼饲养饲料添加剂显著减少相对丰度的鲑鱼相关沙门氏支原体在中部和远端肠道含量；

2. 宏基因组学分析揭示，菌群的精氨酸合成和萜类主链合成途径的改变与支原体的存在直接相关；

3.饲料类型间肠道微生物群组成的差异与代谢组学的显著变化直接相关，包括脂质和类脂类代谢物、氨基酸、胆汁酸和类固醇相关代谢物。

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这是一篇来自Microbiome上发表的一项最新研究结果，分析了在饲料中添加益生菌和合生制剂对虹鳟鱼的肠道菌群组成、功能及肠道代谢产物的影响。不同于以前只是基于数据的推测来进行鱼类的微生物群的研究，本研究利用生长性能和表征肠道环境中微生物组成的研究方法，使用多组学分析来研究复杂的宿主-微生物组间的相互作用，从而更好地评估益生菌的功能潜力，为后续研究生产动物中复杂的宿主-微生物相互作用提供新思路。