EBioMedicine | 重大突破！视网膜样本的DESI-MSI空间代谢组+蛋白组延缓视网膜神经退行性病变研究

2022-06-29 07:49:40, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

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前言

神经退行性疾病是由进行性神经细胞死亡引起的无法治愈的疾病。色素性视网膜炎（RP）是一种致盲性神经退行性疾病，可导致光感受器死亡甚至失去视网膜。通过蛋白质组学和质谱成像技术（空间代谢组学）研究，间接活检视网膜，识别视网膜蛋白质组的变化可为保护视网膜提供理论依据。

2020年1月，美国斯坦福大学拜尔斯眼科研究所和爱荷华大学卡弗医学院Katherine J. Wert 和 Gabriel Velez教授课题组在 EBioMedicine(IF:8.143)发表了题为 “Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration”的研究成果，通过蛋白质组学、DESI-MSI空间代谢组学和LC-MS/MS等多组学研究方法，发现代谢途径和能量通路对视网膜神经的保护作用特征，探究了补充代谢物保护视网膜机理，描绘了视网膜细胞通路中代谢物图谱。为TCA循环和有氧代谢保护视网膜提供了理论依据。

研究思路

研究方法

1. 实验分组

（1）实验组：Pde6ɑ^D670G小鼠，食物中加入生酮、维生素B2和B3、ɑ-KG；饮用水中加入褪黑激素和白藜芦醇

（2）对照组：C57BL/6J (B6)小鼠

2.技术路线

2.1AF/IR：获取视网膜、视神经的图像

2.2免疫细胞化学：视网膜采用共焦显微镜成像

2.3蛋白质组学：玻璃体和视网膜样品进行蛋白质提取和消化

2.4 LC-MS/MS：分析SAX组分

2.5 DESI-MSI（空间代谢组学）：SAM（微阵列显著性分析）技术区分Pde6ɑ^D670G小鼠和ɑ-KG治疗小鼠

2.6统计分析：S-t 检验、单因素方差分析、Tukey’s pos-hoc多重比

研究结果

蛋白质组学研究RP的神经视网膜变化

基因测试显示PDE6A基因中存在p.R102C/p.S303C突变（图1a）。与正常对照组相比（图1b-d），眼底自体荧光（AF）显示高密度中央AF环（图1e-f），光学相干断层扫描（OCT）显示神经元细胞层变薄（图1g）。此外，AF成像上显示高自体荧光环（图1h-i），OCT成像显示视网膜细胞层变薄和黄斑囊样水肿（图1j）。

图1 | 两名常染色体隐性遗传性视网膜色素变性患者携带PDE6A突变

手术时收集液体玻璃体活组织，由于两名arRP患者接受了玻璃体切除术以去除ERM，因此将两名无RP患者的ERM玻璃体样本用作对照（图2a-b）。采用LC-MS/MS蛋白质组学分析玻璃体样品，以确定蛋白质组含量。通过人玻璃体蛋白质组学研究突出了RP疾病进展过程中神经视网膜的变化。

图2 | PDE6A人玻璃体的蛋白质组学分析

蛋白质组学分析确临床表型的蛋白表达改变

ERG分析，小鼠在一个月大时视杆光感受器视觉功能丧失，两个月大时整体视觉功能完全丧失（图3a）。Pde6ɑ^D670G小鼠出生后第14天组织学上可检测到光感受器变性（图3b）。采集患病小鼠的视网膜和玻璃体，并进行LC-MS/MS蛋白组学分析。随着神经退行性变的发展，蛋白质表达减少、蛋白质的降解增加。通过野生型小鼠与Pde6ɑ^D670G小鼠玻璃体中的蛋白质对比，表明神经元细胞死亡是在早期阶段。Pde6ɑ^D670G视网膜和玻璃体蛋白质组学分析确定了可能先于细胞丢失和RP临床表型的整体蛋白表达的改变。

图3 | 早期、中期和晚期视网膜色素变性（RP）患者Pde6ɑ^D670G视网膜和玻璃体的蛋白质组学分析

氧化代谢途径在神经元细胞死亡开始时的Pde6ɑ^D670G视网膜

检测神经元细胞死亡开始时的分化蛋白表达，使用单因素方差分析和分层热图聚类法比较PDE6ɑ^D670G（P15）和野生型小鼠的玻璃体和视网膜蛋白水平。与对照组相比，Pde6α中共有1067个蛋白差异表达D670G样品。对照组视网膜中有446种蛋白在变性过程中缺失，并在病变的玻璃体Pde6ɑ^D670G中也被检测到。表明在RP开始时，446种视网膜蛋白从健康视网膜中耗尽并释放到玻璃体中（图4）。

图4 | Pde6ɑ^D670G视网膜和玻璃体的蛋白质组学分析确定整体蛋白表达变化

视网膜氧化代谢在早期视网膜变性中受到影响，表明视网膜神经网络可能对疾病期间发生的代谢途径内的变化敏感。而早期的Pde6ɑ^D670G小鼠蛋白质组对候选生物标记物的验证和鉴定表明了该治疗方法的潜在靶向途径（图5）。

图5 | 蛋白质组学的arRP代谢物补充方法

生酮饮食延缓arRP小鼠光感受器细胞丢失

生酮饮食治疗arRP小鼠，通过外核层厚度的组织学分析，其感光细胞的存活率较低（图6a）。通过与标准食物喂养的同窝小鼠相比，整体视觉反应有轻微的缓解（图6b），而小鼠的ERG反应无显著差异（图6c-e）。

图6 | 生酮饮食治疗arRP临床前小鼠光感受器细胞存活

口服补充单一代谢物可延长神经细胞存活和视力

Pde6ɑ^D670G小鼠的饮用水中提供α-酮戊二酸、维生素B3、维生素B2、褪黑素或白藜芦醇，治疗一个月后进行ERG视觉功能检查。ERG描记显示，小鼠的视杆光感受器、视杆-视锥光感受器ɑ波反应和全视网膜内暗视ERG均出现视觉改善情况（图7），而补充褪黑素和白藜芦醇后均未显示出对视觉功能的影响（图7b-d）。通过ɑ-KG治疗后，感光细胞（ONL）及其内/外段在统计学上有显著意义（图7e-f）。评估GFAP免疫反应性的分布，表明经过一段时间治疗，补充ɑ-KG不会抑制疾病模型中的Muller胶质细胞激活（图7g）。

图7 | 口服补充单一代谢物可改善arRP临床前小鼠的光感受器细胞存活和视觉功能

视网膜组织切片的空间代谢物/脂质成像

为了研究Pde6α^D670G小鼠的脂质和代谢物分布，选择了35个新鲜冷冻组织样本，并进行负离子模式解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）空间代谢组学研究（图8a）。组织DESI-MS图像质谱表示，确定了分子离子是与糖酵解、TCA循环、脂肪酸和磷脂相关的小代谢物（图8b-d）有关。微阵列显著性分析（SAM）确定了未治疗Pde6α^D670G和α-KG治疗小鼠之间377种差异表达的代谢物有关。虽然DESI-MSI空间代谢组学检测到了α-KG，但Pde6α^D670G和α-KG治疗组之间的差异有限（图8）。

图8 | 视网膜组织切片的DESI-MSI

SAM中差异分布的代谢物表明，未经治疗的Pde6α^D670G和α-KG治疗组之间的几种改变途径与蛋白质组学研究结果一致。根据DESI-MSI空间代谢组学成像和SAM，与未治疗状态相比，治疗状态下的琥珀酸、乌头酸、谷氨酰胺水平均升高，谷氨酸水平略有增加（图9a-d）。DESI-MSI表明补充的α-KG增加了TCA代谢物水平，可能在细胞的抗氧化反应中发挥了一定的作用。

图9 | DESI-MSI数据中野生型、arRP和α-KG治疗小鼠的视网膜脂质和代谢物相对强度分布

相关结论

蛋白质组学和DESI-MSI空间代谢组学技术提供了关键途径，而关键途径内的代谢产物传递显示出对神经系统的有效保护作用。蛋白质组学检测到的OXPHOS和TCA循环关键代谢途径是相关色素性视网膜炎（RP）治疗的关键靶点，但也需要进一步研究此方法是否适用于RP或其他神经退行性疾病。

研究结论

通过液体活检蛋白质组学和DESI-MSI空间代谢组学方法分析色素性视网膜炎（RP）进程中受影响的分子途径靶点。通过口服补充循环代谢物，可保护神经，增强视觉功能，延缓感光细胞的丧失，对感光细胞和内视网膜均提供保护作用。

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参考文献

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