2024-04-16 09:20:41, 赛默飞生命科学 赛默飞世尔科技生命科学产品
TRIzol试剂
1977年,科学家 Axel Ullrich 和他的同事们提出使用异硫氰酸胍(Guanidine Thiocyanate)用于 RNA 的分离纯化,至1990 年,优化该方法后,推出商业化的 TRIzol 试剂。
赛默飞TRIzol试剂是一种即用型试剂,用于在1小时内从人类、动物、植物、酵母或细菌来源的细胞和组织样本中提取高质量的总RNA(以及DNA和蛋白质),TRIzol试剂在样本匀浆化时,可以破坏细胞,溶解细胞组分,同时高效的抑制RNA酶的活性,从而维持RNA的完整性。
TRIzol无氯仿解决方案
由于在TRIzol试剂的提取过程中,需要使用氯仿,而氯仿具有挥发性,会对眼睛、呼吸道、皮肤和黏膜造成刺激,因此迫切需要一种无氯仿解决方案。经过赛默飞科学家的不懈探索,发现了1-溴-3-氯丙烷(1-Bromo-3-chloropropane ,BCP)可以替代氯仿,搭配TRIzol试剂提取RNA,接下来,小编就和大家一睹为快——TRIzol无氯仿提取RNA的效果。
操作流程
在样本进行匀浆化时,加入0.2mL氯仿或者0.1mL BCP,进行RNA提取。
图1. 操作流程示意图,详细步骤如下:
加1mL TRIzol试剂,裂解样本,室温孵育5min。
加0.2 mL氯仿或 0.1 mL BCP,振荡混匀,孵育3min。
在4°C下12000×g离心样本15min。
取约500μL上清液至新样本管中。
加等样本体积的异丙醇,颠倒混匀,在4°C下孵育10min。
在4°C下12000×g离心10min,弃上清。
加1mL 75%乙醇,重悬沉淀,短暂涡旋样本,在4°C下7500×g离心5min,弃上清液。此步骤重复一次。
干燥5-10min,加20-50μL RNase-Free水,在55°C的水浴孵育10min。
实验结果
分别使用氯仿和BCP对5mg和20mg的兔的肝脏和脑组织,按照TRIzol试剂的说明书进行RNA提取,每组实验设置3个重复,对得到的RNA产物进行含量、纯度、完整性等进行评估。
RNA含量和纯度
图2. Nanodrop检测RNA的产量和纯度
RNA完整性测定
图3. Agilent 2100测定RNA完整性和计算RIN指标
RT-qPCR分析
图4. 对提取RNA进行RT-qPCR检测内参基因:GAPDH和ACTA2,说明BCP提取的RNA,与氯仿相比,内参基因表达量无显著差异。
图5. 提取RNA进行Xeno抑制性实验,说明,BCP和氯仿所提取出来的RNA不会扩增抑制后续的RT-qPCR实验,降低假阴性结果的可能性,确保RT-qPCR检测结果是准确和可控的,再次佐证了可以使用BCP搭配TRIzol试剂使用。
小结
在有机法提取RNA的过程中,赛默飞无氯仿提取后的RNA,含量高,纯度好,完整性指数高,可直接做后续的RT-qPCR实验。
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