项目文章 | 蛋白质组学+拟靶向脂质组学揭示叶绿体蛋白泛素化介导的光合作用调控新机制

2023-02-15 03:38:51, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

前言

叶绿体能通过光合作用将二氧化碳转化为碳水化合物，叶绿体功能对蛋白质稳态，细胞器功能和植物发育至关重要。然而关于光合作用中的核心调控机制目前还未知。作者发现光合作用蛋白（包括由叶绿体基因内部编码的蛋白）通过叶绿体蛋白降解途径——Chloroplast-associated Protein Degradation（CHLORAD）发生泛素化修饰。然后这些蛋白被CDC48逆转录到细胞质上后由细胞质中的蛋白酶体进行降解。这表明CHLORAD直接参与调控叶绿体内部蛋白，对叶绿体的作用可延伸到细胞器的内部，用于揭示调控光合作用的新模式。

2022年11月，中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所凌祺桦研究组在Science advances发表了题为“Ubiquitin-based pathway acts inside chloroplasts to regulate photosynthesis”的研究文章，作者发现叶绿体蛋白降解途径Chloroplast-associated Protein Degradation（CHLORAD）通过泛素-蛋白酶体系统（UPS），调控叶绿体外膜蛋白（OEM）逆转运，并被细胞质中的蛋白酶体降解。表明CHLORAD可以直接参与调控一些叶绿体内部蛋白，参与叶绿体功能，如光合作用、脂质代谢、物质转运、抗逆性等，进一步挖掘了CHLORAD的生物学意义。

中文标题：基于泛素的途径在叶绿体内起作用以调节光合作用

研究对象：拟南芥植株

发表期刊：Science advances

影响因子：14.957

发表时间：2022年11月

运用组学生物技术：Label free非标记蛋白质组学、泛素化蛋白质组学、拟靶向脂质组学、转录组学（非标记蛋白质组学和拟靶脂质组学由鹿明生物完成技术支持）

技术流程

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主要内容

1.通过分离和亲和纯化检测叶绿体内部的泛素化

对拟南芥叶绿体进行免疫印迹，检测到纯化叶绿体中高分子量条带（图1A）。条带在嗜热菌蛋白酶（一种去除表面暴露的OEM蛋白的蛋白酶；（图1B）处理叶绿体后仍存在，表明泛素化蛋白可能存在于叶绿体内部，如内包膜（IEM）、基质或类囊体膜。基质有中泛素化蛋白存在（图1C），证明CHLORAD有可能作用于叶绿体内部蛋白质。

图1 | 叶绿体内部的蛋白质被泛素化

2. 泛素化蛋白组学揭示参与光合作用的蛋白被泛素化

为确定叶绿体中CHLORAD底物的泛素化目标及其修饰位点，对野生型拟南芥叶绿体进行蛋白质组学分析。使用CDC48的显性阴性突变体（CDC48-DN）来阻断CHLORAD底物的逆转录。已确定的CHLORAD底物在光合作用成分中显著富集（图2A）。除了OEM蛋白，TOC成分和SP1、SPL2等蛋白，还鉴定出较多的IEM、基质和类囊体蛋白，包括脂氧酶LOX2，捕光叶绿素结合蛋白（LHCPs），以及光系统亚基，如PsaA，PsaB和PsbC（图2B）。

综上研究表明：泛素化是调节叶绿体蛋白质组的一个主要机制，特别是在光合作用方面。叶绿体泛素组每个蛋白质有2.7个泛素化位点，表明叶绿体蛋白广泛泛素化（图2C），多泛素连接类型都存在于叶绿体中（图2D）。此外，还发现了一个泛素连接假定的共识基序（图2E），在以前的全球植物泛素组中没有观察到，这表明一个特定的泛素化过程可能发生在叶绿体内。

图2 | 光合作用和叶绿体内部的其他蛋白质在叶绿体泛素组中很突出

3.定量蛋白质组学显示，CHLORAD可调节多种蛋白质的水平

CHLORAD底物稳态水平在CHLORAD被抑制后会增加。为寻找在CDC48抑制后过度积累的叶绿体蛋白，对表达CDC48-DN或相应的CDC48-野生型（WT）对照的拟南芥进行了非标定量蛋白质组分析。两种基因型中部分蛋白质在CDC48-DN中相对于对照组存在表达水平较高（图3A-B），TOC成分（Toc159、Toc33和Toc75）在CDC48-DN中过度累积。不同验证分析方法都显示了这些蛋白在CDC48-DN细胞中升高，积累的蛋白质在每种情况下都定位在叶绿体中。蛋白质组学中检测到的238个蛋白质中，至少含有一个泛素化位点，其中79个（33%）在CDC48-DN叶绿体中过度累积（图3C），支持它们是CHLORAD底物的观点。

RNA测序（RNA-seq）分析发现，虽然有许多依赖于CDC48的转录变化，但大多数编码在CDC48-DN叶绿体中过度积累蛋白质的转录本没有上调（图3D-E）。与蛋白质水平相反，在CDC48-DN拟南芥中，叶绿体蛋白的mRNA趋于减少（图3D），代表蛋白质丰度的变化是通过翻译后过程介导的。

图3 | 运用定量蛋白质组学鉴定众多的CHLORAD底物

4.证明CHLORAD参与内部叶绿体蛋白的降解

本研究中，许多内部叶绿体蛋白（非OEM蛋白）被意外地推测为CHLORAD的底物。为证实这些蛋白是由泛素-蛋白酶体系统处理的，并确定它们在蛋白酶体抑制后的降解情况。本研究用抑制蛋白酶体和CHLORAD活性的硼替佐米进行处理，发现PrfB3-HA的降解被推迟了（图4A-B）。接下来本研究分析了几个叶绿体编码蛋白在CHLORAD缺陷sp2和CDC48-DN背景下的转换。在用林可霉素处理以抑制叶绿体翻译后，监测蛋白水平。PsaA和PsbC（假定的底物和光合作用成分）的稳定性在CHLORAD缺陷基因型中明显增强（图4C-H）。RPL2（一种叶绿体编码的核糖体蛋白，未被确定为CHLORAD的推定蛋白，用作对照）在sp2和CDC48-DN的背景中不稳定。表明CHLORAD会选择性地作用于多种内部底物，但不是所有的叶绿体蛋白。

为建立CHLORAD与其在叶绿体内部的假定目标之间的直接联系，进行免疫共沉淀实验，发现SP2-6Myc与PrfB3-HA有特异性关联，包括多泛素化的高分子量形式（图4I）。CHLORAD对内部底物稳定性的作用可能是通过直接的物理相互作用来介导的。

图4 | 叶绿体内部的蛋白质由CHLORAD处理

5.证明了CDC48在提取内部叶绿体蛋白中的作用

由于CDC48驱动CHLORAD底物从OEM到细胞膜的逆转定位，为评估CDC48是否同样参与了从叶绿体内部提取底物的过程，本研究对两种叶绿体编码的底物（PsaA和PsbC）进行了体内逆转定位实验。从CDC48-DN和CDC48-WT拟南芥中将硼替佐米处理过的原生质体分离出来并生成叶绿体和细胞质，通过免疫沉淀富集泛素化蛋白。通过免疫印迹法检测叶绿体和细胞质样品中PsaA和PsbC蛋白（图5A）。多聚泛素化的PsaA和PsbC被明显提取到细胞质中，表明叶绿体内部蛋白可以从细胞器中输出，CDC48在处理这种内部叶绿体蛋白中起着重要作用（图5）。

图5 | CDC48是提取多泛素化光合作用蛋白的必要条件

6.评估CHLORAD对光合作用和脂质稳态的生理重要性

CDC48-DN的短期表达会导致植物萎黄（图6A），研究发现CDC48-DN拟南芥的叶绿体含有扩大的质体球（图6B-C），与光系统成分平衡被破坏而引起的氧化应激结果一致，与幼苗的萎黄表型有关（图6B和D）。CDC48-DN叶绿体含有较大的颗粒（堆积的类囊体，PSII集中于此）和较少的基质类囊体（图6B和E）。本研究接下来分别在CDC48-DN和sp2突变体拟南芥以及相应的对照组中，同时测量了PSI和PSII的能量转换，确定电子传输率（ETR）参数ETR(I)和ETR(II)（图6F-I）。虽然CDC48-DN和sp2拟南芥没有显示出与各自对照组的明显差异，但ETR(II)值都明显升高，意味着CHLORAD通常会限制PSII活性。

叶绿体也是植物中脂肪酸合成的主要场所。通过泛素组学和定量蛋白质组学，两个参与脂肪酸代谢的叶绿体外膜蛋白FAX1和LACS9被确定为候选CHLORAD底物。CDC48-DN中，总共检测到24种水平显著不同的脂肪酸（Fatty Acids）。叶绿体产生的FAs（16:0，18:0，18:1）减少，内质网的FA（24:0；图6J）增加，支持CHLORAD影响FA到功能性内质网的假设。除了溶血磷脂酰胆碱（18:3）和磷脂酰甘油（16:0/18:1；图6J）之外，大多数脂质种类在CDC48-DN拟南芥中都明显减少。反映了与CHLORAD正常调节丧失相关的脂肪酸和脂质稳态被破坏。

图6 | CHLORAD 是正常光合功能和脂质体内平衡所必需的

内容总结

本研究确定了CHLORAD的靶标和泛素化位点。通过蛋白质组学、泛素化蛋白质组学、拟靶向脂质组学、转录组学等分析，发现CHLORAD直接作用于多种叶绿体蛋白，并且泛素-蛋白酶体系统广泛影响叶绿体功能，包括光合作用和脂质代谢。这些发现为栽培植物的改良提供了机会（例如，最大限度地提高光合活性），有助于为解决粮食安全和碳中和等全球挑战提供参考。

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