Theranostics | PROTAC选择性地促进tau清除以改善阿尔茨海默病样模型中的认知功能

tau蛋白细胞内积累是阿尔茨海默病（AD）和相关tau病的标志性病理学，因此靶向tau蛋白可能有望用于药物开发。蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）是一种从细胞内选择性降解蛋白质的新型药物发现策略。PROTAC（C004019）通过促进其在具有稳定tau过表达（hTau）的HEK293细胞中的泛素化-蛋白酶体依赖性蛋白水解以及过表达hTau的SH-SY5Y诱导了强大的tau清除。

本篇由华中科技大学同济医学院病理生理学系王建枝教授研究团队在Theranostics期刊（IF:11.600）发表的“A novel small-molecule PROTAC selectively promotestau clearance to improve cognitive functions inAlzheimer-like models”的文章，文章发现了一种新的药物C004019能够靶向tau，用于从细胞内选择性降解蛋白质，同时招募tau和E3连接酶（Vhl），选择性增强tau蛋白的泛素化和蛋白水解。

研究发现C004019通过促进其泛素化-蛋白酶体依赖性蛋白水解，在HEK293细胞中稳定或短暂过度表达hTau，诱导tau的清除。单剂量和多剂量皮下注射C004019可显著降低野生型、hTau转基因和AD小鼠大脑中的tau水平，改善突触和认知功能，这为AD及相关tau蛋白疾病提供了一种有希望的候选药物。

1、C004019通过泛素-蛋白酶体系统诱导不同细胞模型中的tau清除

PROTAC（C004019）分子量为1，035.29Da（图1A-B）。通过CCK8测定在具有野生型全长人tau（称为HEK293-hTau）稳定表达的HEK293细胞中测试了分子的毒性（图1C）。C004019处理诱导HEK293-hTau中多个AD相关位点的总tau（Tau5）和tau磷酸化（p-tau）的浓度依赖性降低（图1D-E）和SH-SY5Y（图1F-I）细胞也是同样的检测结果。不同剂量给药发现到10μM的C004019可以有效地降低p-tau和总tau水平（图1H-I）。免疫荧光染色检测了总蛋白和p-tau蛋白的C004019浓度依赖性清除率（图1J），研究显示C004019没有显著改变tau的mRNA水平（图1L）。同时，C004019处理显著提高了tau的泛素化水平（图1K）。通过用蛋白酶体抑制剂MG132同时处理HEK293-hTau细胞，消除了C004019诱导的tau清除（图1M-N）。

2、脑室内给药C004019促进野生型和3xTg小鼠体内tau清除

脑室内输注C004019在24 h诱导的海马tau减少最显著，并且在48 h时减少仍然非常显著，尽管略小于24 h（图2A-B）。在大脑皮层中，仅在48小时而不是24小时检测到tau的显著减少（图2C-D）。脑室内给药C004019降低了海马体和皮质中的总tau和p-tau水平（图2E-J）。确认C004019的特异性，作者测量了另一种微管相关细胞骨架蛋白MAP2的蛋白质水平。C004019在4月龄野生型和9.5月龄3xTg-AD小鼠中均未改变MAP2水平（图2A-H）。

3、单剂量皮下给药C004019诱导野生型小鼠大脑中的tau清除

在皮下给予15 mg/kg的C004019后24 h和48 h，在海马体和皮质中检测到tau蛋白显著减少（图3A-C）。出乎意料的是，皮下给予低剂量C004019（3mg / kg）24小时在海马和皮质中诱导的tau减少比高剂量（15mg / kg）更显著（图3D-F）。单剂量施用C004019（3mg / kg）诱导tau蛋白持续减少至8天，尽管显示tau水平随时间恢复的趋势（图3D-F）。测试C004019胃内强饲法（20mg / kg，48h）的效果，但没有检测到明显的tau减少（图3G-J）。检测发现脑组织最大浓度C004019与血浆最大浓度（Kpuu值）之比为0.00866（图3K）。

4、多剂量皮下给药C004019可促进hTau和3xTg-AD小鼠的tau清除，改善认知和突触功能

C004019给药后第48天处死小鼠（图4A)，与载体对照相比，不频繁皮下给药C004019显著降低了海马提取物中的总和p-tau水平（图4B-C）。同时观察到不频繁的皮下递送C004019可以减少可溶性和不溶性tau，更有效地减少可溶性部分中的tau（图4D-G）。免疫组织化学染色也显示 C004019 处理组的 p-tau 和 tau 聚集减少（图4H-I）。不频繁的皮下注射C004019显著减轻了小鼠的认知缺陷，表现为在新型物体识别（NOR）测试中探索新物体的时间增加（图4L），并改善了恐惧条件（FC）测试中的冻结指数（图4M），以及在六天的学习试验期间找到平台或在莫里斯水迷宫（MWM）测试的探测试验期间到达平台象限的延迟降低（图4N-P）。C004019组海马DG神经突起化和脊柱密度较载体对照显著增加（图4Q-R）。数据表明不频繁地皮下给药C004019可以改善hTau转基因小鼠模型中的认知功能和树突可塑性。

进一步的研究表明，C004019显著降低了海马和皮质提取物中的可溶性和不溶性tau水平，有效地降低了可溶性部分中的tau（图5A-H）使用T22发现C004019显著降低了可溶性级分中的T22阳性tau（图5I-L）。由于~110 KDa处的条带不够暗（图（图5I，5IK左图），作者通过更长的曝光来增强波段（图5I，5K右图），使用pS404和AT8的免疫组织化学染色和硫黄素S染色显示C004019处理组中p-tau蛋白和聚集tau蛋白的减少（图5M-Q）。染色未发现对淀粉样蛋白β斑块有显著影响（图5R-S）。数据进一步证实不频繁的皮下给药C004019可以促进AD小鼠tau蛋白的清除。

与年龄匹配的S129对照相比，3xTg小鼠在NOR测试中的辨别指数降低，而C004019治疗几乎完全恢复了记忆能力（图6B-C）。在MWM测试中，与载体处理的3xTg小鼠相比，用C004019处理的3xTg小鼠在6天的学习试验中到达平台的延迟更短，平台交叉和目标区域交叉增加（图6D-H），表示C004019对空间学习和记忆的拯救。在FC试验中，C004019处理恢复了3xTg小鼠的冷冻指数（图6I）。3xTg-AD小鼠的脊柱数量减少，LTP诱导受损，而不频繁的皮下给药C004019恢复了脊柱密度（图6K-L）和LTP感应，包括fEPSP幅度和斜率（图6M-O），但对神经突起树化没有任何影响（图6J）。数据证实C004019的外周给药确实可有效改善3xTg-AD小鼠的认知和突触功能。

tauPROTAC可以选择性地有效地诱导tau清除，并在不同的hTau细胞模型以及AD样hTau和3xTg转基因小鼠中显着改善突触和认知功能。

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（1）基于DIA和TMT的广泛非靶蛋白检测，分析PROTAC处理后靶蛋白降解效率和脱靶效应；

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（3）基于AP-MS互作蛋白质组学技术，验证靶蛋白与E3泛素连接酶的相互作用关系；

（4）基于泛素化蛋白组学技术，研究PROTAC处理后靶蛋白降解的泛素化作用机制；

（5）基于Simple/Digital Western（传统Western blot的高配版）蛋白定量技术，定量准、重现性好、检测效率高，可在细胞水平和类器官模型，动物等不同层面评估靶蛋白降解情况，测定量效关系，计算DC50或DC90值等，是PROTAC开发的有力工具。

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1.Wang W, Zhou Q, Jiang T, et al. A novel small-molecule PROTAC selectively promotes tau clearance to improve cognitive functions in Alzheimer-like models. Theranostics. 2021;11(11):5279-5295. Published 2021 Mar 11. doi:10.7150/thno.55680

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撰稿人|老杨资讯

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