项目文章 | 转录组+蛋白组学助力中科院上海营养与健康研究所探究成肌细胞分化机制

2021-11-17 18:18:50, 多层组学定制服务 上海鹿明生物科技有限公司


点击上方蓝色字体关注我们

蛋白组学、代谢组学服务专家

(点击图片了解详情)


● 前言



2021年10月,中国科学院上海营养与健康研究所武爱波研究员课题组在Ecotoxicology and Environmental Safety发表了题为“Mycotoxin deoxynivalenol affects myoblast differentiation via downregulating cytoskeleton and ECM-integrin-FAK-RAC-PAK signaling pathway"的研究成果,通过转录组学和蛋白质组学研究方法,探究了脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对成肌细胞分化的影响,发现了DON处理使得细胞骨架蛋白和细胞外基质蛋白表达下调,并抑制ECM-integrin-FAK-RAC-PAK信号通路的机理,为食品和饲料污染的防治提供了理论依据。



中文标题:霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇通过下调细胞骨架和ECM-integrin-FAK-RAC-PAK信号通路影响成肌细胞分化

研究对象:脱氧雪腐镰刀菌烯醇、C2C12细胞

发表期刊:Ecotoxicology and Environmental Safety

影响因子:6.291

发表时间:2021年10月

发表单位:中国科学院上海营养与健康研究所

运用生物技术:转录组学和蛋白质组学(由欧易/鹿明生物提供技术支持)、免疫荧光、免疫印迹、PCR


● 研究背景



镰刀菌毒素是微生物的次生代谢产物,自然界中广泛存在,会污染多种作物,对人类和动物构成潜在的健康危害。在镰刀菌毒素中,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是一种常见的B型单端孢霉烯真菌毒素,因其高污染水平和一系列毒性作用而受到广泛关注,其毒性作用包括生长迟缓、体重减轻、厌食和神经内分泌变化。DON在谷物储存和加工过程中保持相对稳定,使其能够在人类和动物食用的食物中持续存在。一些研究表明肌肉可能是DON的靶组织,影响人类和动物的生长发育。然而关于DON对肌肉毒性的研究较少,相关机制尚不完全清楚。


成肌细胞分化为肌管是肌肉发育的一个基本过程,包括迁移、粘附、伸长、细胞识别、排列和成肌细胞膜融合,从而形成肌管。细胞骨架形成和细胞外基质(ECM)-整合素受体相互作用与成肌细胞分化密切相关。成肌细胞迁移取决于细胞骨架的动态,主要与肌动蛋白和调节剂有关;伸长、粘附和细胞间识别取决于整合素和细胞骨架蛋白之间的相互作用。作为基质的锚点,粘着斑可以将ECM连接到肌动蛋白细胞骨架,在细胞粘附中起重要作用,粘着斑激酶(FAK)是其中的关键分子。作为FAK和肌动蛋白细胞骨架之间的重要调节分子,Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物(RAC)通过与p21激活激酶(PAKs)结合,在细胞骨架重排事件期间的肌动蛋白聚合调节中发挥关键作用。


卫星细胞是位于基底层下方的骨骼肌干细胞,为肌肉的生长、修复和再生提供肌核。卫星细胞在肌肉损伤时被激活,增殖并分化为成肌细胞。C2C12细胞是源自卫星细胞的鼠类成肌细胞系,通常用作肌肉再生的体外模型。此外,C2C12细胞广泛地用于药物的肌肉毒性评估和相关保护药物的筛选。


● 研究思路



(点击图片查看大图)


● 研究结果



1. DON以剂量依赖性方式抑制肌管的形

作者首先进行剂量反应实验以观察DON对分化的肌管形态的影响(图1)。分化2天后观察到初始多核肌管(图1A)。分化4天和6天后可以观察到新生肌管和成熟肌管(图1B-C)。在0和0.25μM DON组中清楚地观察到多核肌管。在0.5μM组观察到一些初始多核肌管。然而,在1和2.5μM DON组中没有观察到肌管(图1)。此外,在用1和2.5μM DON处理后,细胞(细胞核)的密度随着DON浓度的增加而降低(图1)

图1 | 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对C2C12分化的影响


2.DON通过抑制细胞活力和诱导细胞凋亡引起细胞毒性

除0.25μM DON组外,所有DON处理组的细胞活力均显著低于对照组(图2A)。细胞活力与DON的浓度成反比。与对照组相比,0.25、0.5、1和2.5μM DON处理2d后细胞活力分别为98%、88%、67%和51%;DON处理4天后细胞活力分别为96%、81%、54%和22%,4天和6天无显著差异(图2A)结果表明DON处理后细胞活力受到显著抑制。接着作者通过流式细胞术分析用DON处理的细胞凋亡(图2B-D)


尽管在DON处理2天后早期凋亡细胞的数量略有增加,但没有显著差异(图2B)。DON处理4天后,活细胞比例下降,早期凋亡细胞比例增加,凋亡率最高为30%(图2C)。DON处理6天后,现象与4天相似,最高凋亡率为16%(图2D)这些结果表明DON诱导细胞的早期凋亡。分化4天和6天后可清晰观察到多核肌管(图1),4天和6天细胞活力无显著差异,而4天凋亡程度高于6天,这可能与细胞状态的恶化有关(图2)。在1和2.5μM DON下未观察到肌管(图1),2.5μM下的细胞活力太低,无法进行后续实验(图2)。总之,用0-1μM DON处理4天的C2C12细胞更适合后续实验。

图2 | DON通过降低细胞活力和增加细胞凋亡在C2C12细胞中诱导毒性


3.转录组学和蛋白质组学分析

接着作者通过转录组学蛋白质组学分析暴露于DON的C2C12细胞的差异基因(DEG)。转录组学鉴定了2387个DEG,其中72%被下调。蛋白质组学鉴定出402个DEG,其中74%被下调。GO和KEGG通路富集分析表明,转录组学DEGs参与了“男性主要性征的发育”、“骨骼肌肌球蛋白粗丝组装”和“骨骼肌收缩的调节”等生物学过程。最富集的通路是“ECM-受体相互作用”、“人乳头瘤病毒感染”和“蛋白质消化吸收”。在蛋白质组学分析中,富集到了“肌肉收缩”、“中间丝解聚”和“脂质转运”等生物学过程。细胞成分中富集到“细胞骨架”、“细胞外基质”和“整合素”。KEGG通路富集到“新霉素、卡那霉素和庆大霉素生物合成”、“系统性红斑狼疮”、“ECM-受体相互作用”和“蛋白质消化和吸收”。前两条通路与上调的DEG相关,而后两条通路与下调的DEG相关,这与转录组学结果一致。


4.差异基因的整合分析

为了更好地了解DON对C2C12细胞分化的影响,作者进行了转录组学和蛋白质组学的整合分析。共鉴定了149个共同的显著差异基因(co-DEG),其中91%被共下调(图3A)。15%的co-DEG属于真核细胞骨架,其中大部分属于肌动蛋白丝,少数是中间丝和微管的成分。对co-DEG进行GO分析,生物学过程富集了“骨骼肌肌球蛋白粗丝组装”和“快肌纤维收缩的正向调节”条目。细胞组分中富集的前五个条目是“纤维蛋白原复合物”、“细胞外空间”、“细胞外基质”、“细胞外区域”和“蛋白质细胞外基质”,这些都是细胞外成分(图3B)。结果表明,DON主要影响肌肉成分的组成和功能以及多种细胞外成分的表达。通路富集分析富集到了“ECM-受体相互作用”、“蛋白质消化和吸收”、“人乳头瘤病毒感染”和“粘着斑”等通路(图3C)

图3 | 转录组学和蛋白质组学的整合分析


5.DON下调各种细胞骨架基因的表达

由于成肌细胞分化取决于细胞骨架的动态,作者进行了RT-qPCR以检测各种骨骼肌相关细胞骨架蛋白的基因表达。如图4A所示,当细胞用1μM DON处理时,肌动蛋白α(actn3)和肌钙蛋白的表达显著降低。Acta1、肌球蛋白重链、mylpf、nes、myot、tmsb4x和vim响应于较低浓度的DON显著降低。与骨骼无关的细胞骨架基因,如acta2和β-肌动蛋白的表达没有显著差异。在这些下调基因中,除acta1(属于肌动蛋白)、nes和vim(属于中间丝)外,所有基因均属于肌动蛋白结合蛋白,表明DON影响细胞骨架组成,主要作用于肌动蛋白结合蛋白。下一步检测TNNT1、TNNC1、MLC2、ACTA2和β-ACTIN的蛋白表达水平。与对照组相比,TNNT1、TNNC1和MLC2的表达在1μM DON下显著降低(图4B-C),而ACTA2和β-ACTIN的表达没有显著变化(图4D-E),这与RT-qPCR结果一致。

图4 | 细胞骨架蛋白的表达


6.DON抑制ECM-integrin-FAK-RAC-PAK信号通路

接着作者分析了一些细胞外基质蛋白和整合素受体的表达。DON处理后胶原蛋白(col1a1、col3a1、col6a1和col6a2)、纤连蛋白1(fn1)、胸腺素(thbs1)和骨桥蛋白(opn)的表达显著降低。接着检测了其中一些基因的蛋白质水平。与对照组相比,FN1和OPN的表达显著降低,而COL3A1的表达没有显著差异(图5B-C)。在整合素受体中,发现整合素α3(itga3)的mRNA表达在DON处理后下调(图5A),而蛋白质表达没有显著变化(图5D-E)。作者进一步选择了两种常见的整合素基因,即整合素αV(itgav)和整合素β5(itgb5)。与对照组相比,DON处理后itgav和itgb5的转录水平和蛋白水平都显著降低(图5)。由于“粘着斑”也受到DON的影响(图3C),因此作者进一步检测了FAK及其酪氨酸激酶的表达。结果发现在DON处理后FAK及其酪氨酸激酶的蛋白质表达发生显著变化(图6A-B)。同时RAC和PAK1的蛋白表达显著下调(图6C-D)这些结果表明DON抑制了ECM-integrin-FAK-RAC-PAK信号通路。

图5 | ECM和整合素受体的表达

图6 | FAK和下游RAC和PAK1的表达


研究结论



本文研究表明,即使在安全浓度范围内,DON也会影响成肌细胞的分化,并提供了可能的分子机制(图7)。DON抑制C2C12细胞的分化,其机制涉及细胞活力、细胞骨架蛋白表达和ECM-integrin-FAK-RAC-PAK信号通路的下调。了解DON对成肌细胞分化的影响,有助于食品和饲料污染的防治。

图7 | DON处理后成肌细胞分化的过程和信号通路


小鹿推荐

作为一种常见的真菌毒素,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)在田间或加工和储存过程中会污染谷物和饲料。DON在动物中会引起厌食和生长迟缓在内的一系列不良反应。本文作者使用转录组学蛋白质组学技术对鼠C2C12细胞进行了研究,分析DON对成肌细胞分化的影响。研究结果表明,DON通过下调细胞骨架和ECM-integrin-FAK-RAC-PAK信号通路来影响成肌细胞的分化。本文研究体现了组学技术在机制研究中的重要作用。


参考文献:

Bingxuan Jia et al. Mycotoxin deoxynivalenol affects myoblast differentiation via downregulating cytoskeleton and ECM-integrin-FAK-RAC-PAK signaling pathway. Ecotoxicol Environ Saf. 2021 Dec 15;226:112850.


.

文末看点lumingbio

鹿明生物双十一·限时购:2999元/样享TMT蛋白组学赠LC-MS非靶向代谢组学活动倒计时1天,抓住双十一最后的尾巴,快点来加购吧!咨询请长按扫码文章末尾的鹿小明咨询我们技术工程师哦~



猜你还想看


封面文章 | 再帕尔·阿不力孜、贺玖明研究团队运用空间代谢组学绘制大鼠脑代谢网络图

NAT MED | 空间代谢组学+多组学技术探究人类结核肉芽肿中的炎症信号的空间分布

恭喜 | 浙江大学药学院何俏军、罗沛华团队自噬诱导心肌细胞死亡机制喜发生物一区顶刊

恭喜 | 浙江省农科院科研团队运用代谢组+转录组在农药联合暴露效应机制研究中取得新进展


END

云起 撰文

欢迎转发到朋友圈

本文系鹿明生物原创

转载请注明本文转自鹿明生物

我知道你在看

点“阅读原文”了解更多


  • 客服电话: 400-6699-117 转 1000
  • 京ICP备07018254号
  • 电信与信息服务业务经营许可证:京ICP证110310号
  • 京公网安备1101085018
  • 客服电话: 400-6699-117 转 1000
  • 京ICP备07018254号
  • 电信与信息服务业务经营许可证:京ICP证110310号
  • 京公网安备1101085018

Copyright ©2007-2021 ANTPEDIA, All Rights Reserved