恭喜 | 浙江省农科院科研团队运用代谢组+转录组在农药联合暴露效应机制研究中取得新进展

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浙江省农科院农产品质量营养所风险评估研究团队联合浙江工业大学在农药联合暴露效应机制研究中取得新进展，作者：杨桂玲，王彦华，李健，王豆，鲍志伟，王强（通讯作者），靳远详（共同通讯作者），在Journal of Hazardous Materials期刊发表了题为“Health risks of chlorothalonil, carbendazim, prochloraz, their binary and ternary mixtures on embryonic and larval zebrafish based on metabolomics analysis”的研究成果，通过代谢组学+转录组学的多组学整合分析技术来阐明几种杀菌剂或其混合物在斑马鱼早期发育阶段的复杂病理生理和毒性通路。

近年来，农药毒性问题越来越受到人们的关注。百菌清(CTL)、多菌灵(CBZ)和咪鲜胺(PCZ)是许多国家广泛使用的杀菌剂，由于杀菌剂的低毒性，其对动物和人类健康的潜在影响常常被忽视。然而，随着分析技术的发展，杀菌剂在不同实验模型中的毒性数据显著增加。本研究将斑马鱼胚胎和仔鱼暴露于CTL、CBZ和PCZ三种单一杀菌剂和其二元、三元混合物中24 h，探讨杀菌剂对特别是发育早期的斑马鱼的潜在健康风险，本研究认为获得的数据可以为不同类型杀菌剂及其混合物对水生生物的毒性提供理论依据。

1. CTL、CBZ和PCZ及其混合物改变代谢物数量

各杀菌剂处理组增加的代谢物数量大于减少的代谢物数量。CTL、CBZ和PCZ暴露后，斑马鱼仔鱼体内代谢产物的变化量大于胚胎。（图1A和B）且CBZ+ PCZ处理的仔虫代谢产物增加的数量大于其他组(图1D)。有趣的是，在胚胎和仔鱼中，CTL+PCZ组改变的代谢物数量均低于其他混合组。此外，暴露于三元混合物(CTL+CBZ+PCZ)组的代谢产物变化数量与其他处理无较大差异(图1C和D)。

图1 | CTL、CBZ和PCZ及其二元和三元混合物作用24 h后胚胎和仔鱼代谢产物的数量变化

2.CTL、CBZ、PCZ及其二元混合物对胚胎和仔鱼代谢产物的影响

通过PLS-DA分析探讨CTL、CBZ、PCZ及其二元混合物与对照组之间的代谢差异，发现杀菌剂处理组与对照组之间的偏差远大于处理组。例如，CBZ、PCZ或CBZ+PCZ处理后的仔鱼代谢产物偏离对照；但不同杀菌剂处理组间无差异(图2F)。此外，在不同组代谢物改变的数量上，CTL+PCZ处理的胚胎或仔鱼的代谢物改变数明显低于其他杀菌剂处理组。例如，与对照组相比，CTL+PCZ处理仔鱼组中只观察到9种代谢产物的变化(图2B)。此外，在CTL、PCZ和CTL+PCZ处理的胚胎和仔鱼中，只观察到4种常见的改变代谢物(图2B和E)。

图2 | PLS-DA分析不同杀菌剂处理组代谢产物改变以及相应Venn图

3.CTL、CBZ、PCZ及其三元混合物对胚胎和仔鱼代谢产物的影响

根据Bray-Curtis距离分析的主成分分析(PCA)，对照组与单一杀菌剂或三元混合暴露组的胚胎代谢产物没有差异(图3A)，而仔鱼代谢产物与对照组不同(图3C)。通过对显著变化代谢物的比较分析，在胚胎和仔鱼中分别鉴定出9个和26个三种单一杀菌剂及其三元混合物的代谢物（图3B和D）。在所有改变的代谢产物中，2-氨基己二酸(2-AAA)在胚胎和仔鱼所有杀菌剂处理组中均存在。

图3 | 斑马鱼胚胎和仔鱼经CTL、CBZ和PCZ及其二元、三元混合物处理后代谢产物的改变

4. 胚胎和仔鱼的主要代谢途径发生显著改变

图4和图5显示了斑马鱼胚胎和仔鱼中各杀菌剂处理组的途径分析结果，表明杀菌剂CTL、CBZ、PCZ或其混合物干扰了斑马鱼的主要代谢途径。

经单一杀菌剂处理后，胚胎中的缬氨酸和半胱氨酸相关通路均发生了改变。此外，三种杀菌剂对胚胎中脂肪酸的生物合成产生影响（4A,B,C），对仔鱼中缬氨酸和精氨酸的生物合成、半胱氨酸代谢和蔗糖代谢也有影响（图4D,E,F）。

图4 | CTL、CBZ和PCZ暴露24 h后胚胎和仔鱼改变的代谢通路富集情况

二元混合物处理组均可影响胚胎中精氨酸的生物合成（图5A,B,C），三元混合物处理组的仔鱼体内缬氨酸、精氨酸和半胱氨酸相关通路明显改变（图5D）。具体来说，在CTL+CBZ、CBZ+PCZ和CTL+CBZ+PCZ处理的仔鱼中，丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸和甘氨酸相关的生物合成途径发生了改变（图5E,G,H）。此外，与其他组相比，CTL+PCZ处理组的改变通路总数明显减少（图5F）。

图5 | 二元和三元混合物组暴露24 h后胚胎和仔鱼改变的代谢通路富集情况

5. 杀菌剂处理组对氨基酸水平的影响

本研究计算出所有杀菌剂处理组中20个氨基酸的相对水平(图6)。精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和缬氨酸是胚胎和仔鱼中经杀菌剂处理后受影响最大的4种氨基酸，然而，在CTL+ PCZ处理组中，斑马鱼胚胎和仔鱼的氨基酸均未见明显变化。

图6 | 各杀菌剂处理组对斑马鱼胚胎和仔鱼氨基酸代谢的影响

6. 杀菌剂处理组对斑马鱼胚胎和仔鱼相关基因转录水平的影响

2- AAA与胰岛素抵抗密切相关，是预测未来2型糖尿病风险增加的标志物，其水平的升高与葡萄糖稳态和脂肪分化密切相关，并且所有杀菌剂处理组的葡萄糖水平也显著升高(图3D)。本研究进一步分析了用不同杀菌剂处理的斑马鱼胚胎和仔鱼中几个关键的糖酵解相关基因。如图7所示，所有杀菌剂处理组斑马鱼胚胎和仔鱼的葡萄糖激酶(GK)、己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶（PK）水平均升高。GK、HK、PK是催化葡萄糖转化为丙酮酸的三个关键基因。研究人员认为这些基因转录的增加与葡萄糖水平的升高密切相关，也就是说，杀菌剂处理后，2-AAA和葡萄糖水平升高，说明在斑马鱼的早期发育阶段，葡萄糖代谢受到了明显影响。

图7 | 杀菌剂处理组对斑马鱼胚胎和仔鱼GK、HK和PK转录组的影响

7. CTL+PCZ对灰霉病菌的杀菌能力

为研究CTL+PCZ对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的杀菌能力，研究人员用有效浓度对灰霉病菌进行了几次小规模生物试验。CTL和PCZ在培养20、30和40 h后，均以浓度依赖的方式抑制灰霉病菌的生长。40 h后，CTL的IC50值为475.34 μg/L, PCZ的IC50值为29.58 μg/L(图8A和B)。CTL+PCZ暴露浓度设定为500μg/L+ 30 μg/L。与CTL (500 μg/L)和PCZ (30 μg/L)组相比，CTL+PCZ组的抑菌率明显升高(图8C和D)，说明CTL和PCZ的双重混合物对化合物的杀菌能力没有影响。

图8 | CTL+PCZ对灰霉病菌的杀菌能力

在本研究中，研究人员整合代谢组学+转录组学技术来阐明几种杀菌剂或其混合物在斑马鱼早期发育阶段的复杂病理生理和毒性通路。这些杀菌剂显著地改变了斑马鱼胚胎和仔鱼的代谢谱。在暴露于单一杀菌剂后，斑马鱼仔鱼体内代谢产物的改变数量远低高于胚胎，研究认为这种差异是由斑马鱼不同的发育阶段造成的。

2-氨基己二酸(2-AAA)在斑马鱼胚胎和仔鱼的所有单一或混合处理组中均显著增加，表明2-AAA是评估这些杀菌剂健康风险的潜在有用的生物标志物。杀菌剂处理后，葡萄糖水平升高，代谢途径分析显示，氨基酸代谢相关途径是杀菌剂处理反应中的重要途径，这些结果表明,氨基酸代谢与葡萄糖代谢可能紧密联系斑马鱼的代谢平衡和成长发展。

不同农药的联合效应在毒性评价中具有重要意义。与其他组相比，在CTL+ PCZ处理组中，斑马鱼胚胎和仔鱼的氨基酸均未见明显变化，与CTL或PCZ相比，CTL+PCZ对灰霉病菌具有更强的抑制作用，说明联合使用CTL和PCZ并不影响其杀菌活性。考虑到CTL和PCZ对非靶鱼的低毒性和高杀菌活性，建议联合使用。

总之，这些从代谢组学分析中获得的数据为理解三种不同类型杀菌剂或其混合物对水生生物的作用机制提供了重要信息。

近年来，人们越来越关注农药对非靶生物健康的影响。但由于杀菌剂复杂的毒性作用，单一和联合杀菌剂的作用机制尚不清楚。代谢组学分析是一个强有力的工具应用于环境毒理学，它可以表征环境化学品的代谢变化，从代谢组学分析中获得的数据为研究三种不同类型杀菌剂或其混合物对水生生物的作用机制提供重要信息。

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甜橙诚 撰文

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