NAT MED | 空间代谢组学+多组学技术探究人类结核肉芽肿中的炎症信号的空间分布

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● 前言



哈佛大学公共卫生学院免疫与传染病学系Mohlopheni J Marakalala教授课题组在Nature Medicine刊发表了题为“Inflammatory signaling in human tuberculosis granulomas is spatially organized"的研究成果,通过空间代谢组学+蛋白组学+LC-MS靶向代谢组学研究方法,发现了人结核病肉芽肿组织中炎症信号的空间分布特征,探究了结核病疾病发生机理。为结核病临床研究提供了理论依据。



中文标题:人结核病变组织-肉芽肿中炎症信号的空间分布研究

研究对象:人结核肉芽肿组织

发表期刊:Nature medicine

影响因子:53.440

发表时间:2016年4月4日

运用生物技术:空间代谢组学、激光显微切割技术、Label free蛋白质组、免疫组化(IHC)、LC-MS靶向代谢组学


● 研究背景



结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的疾病,在全球范围内每年造成150万人死亡。当MTB在肺部播散时,病菌和宿主之间产生的一系列相互作用诱导肺部组织重塑,从而产生慢性炎症病变,即肉芽肿。肉芽肿是肺结核(TB)的病理标志,然而,它们的功能和形成机制尚不清楚。为了了解肉芽肿在结核中的作用,研究人员利用激光捕获显微技术切割不同区域的组织,结合Label free蛋白质组学对不同组织区域的蛋白种类以及富集通路进行分析。


● 研究思路



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● 研究结果



1. 激光显微切割技术切割不同类型的肉芽肿+Label free蛋白质组技术筛选差异蛋白

利用激光显微切割技术来分离组织学上不同的5个区域:实性肉芽肿活性组织,干酪样肉芽肿和空腔肉芽肿的活性组织,以及干酪样肉芽肿和空腔肉芽肿的坏死组织(样本策略)并采用Label free蛋白质组定量法对这5种样本的蛋白质组进行分析,比较蛋白质的相对丰度(图1b)。结合所有显微解剖肉芽肿区域的分析,鉴定到4406个蛋白,其中>3500个蛋白同时出现在4个样本(图1c和补充图1b和2a,b)并使用这些数据创建了人类肉芽肿蛋白表达的空间解析图。

图1 | 肉芽肿蛋白成分的高分辨率质谱分析


(a)本研究中三种类型肉芽肿的代表性HE染色图像——实性(上)、干酪性(中)和空洞性(下)肉芽肿;

(b)实验工作流程示意图。利用激光显微切割技术将肉芽肿区域划分为5不同类型实性肉芽肿活性组织,干酪样肉芽肿和空腔肉芽肿的活性组织,以及干酪样肉芽肿和空腔肉芽肿的坏死组织随后进行Label free分析;

(c)所有肉芽肿中共鉴定了4406个蛋白,图中蛋白数量为以上五个类型中蛋白数量的分布情况。


2.Label free蛋白质组学分析5个肉芽肿样本的差异

经过对Label free蛋白质组学数据的分析发现,蛋白肉芽肿内部的变异比肉芽肿亚型之间的变异更加值得关注。PCA聚类发现,不同类型肉芽肿的活性组织聚集在一起,坏死组织聚在一起(图2a和补充图2a)。研究人员对差异蛋白的GO功能和KEGG通路进行富集分析,发现具有显著差异的功能蛋白主要参与炎症和抗菌过程(图2c)。已知的抗真菌蛋白,如抗菌肽、活性氧(ROS)激活蛋白、肿瘤坏死因子(TNF)下游的抗菌蛋白和干扰素(IFN)信号在活性组织与坏死组织中差异显著(图2d)。在坏死样本中,代谢花生四烯酸(AA)的蛋白质,包括花生四烯酸5-脂加氧酶(ALOX5)、ALOX5激活蛋白(ALOX5AP)和白三烯A4水解酶(LTA4H)显著上调,这些发现与坏死组织内的促炎信号一致,提示二十烷类(花生四烯酸的产物和结核病感染过程中的关键炎症介质)可能在肉芽肿形成中发挥重要作用。

图2 | Label free蛋白质组学分析5个肉芽肿样本中差异蛋白的分布情况


(a)实性肉芽肿活性组织、空腔肉芽肿活性组织、空腔肉芽肿坏死组织和干酪样肉芽肿坏死组织的差异蛋白表达强度层次聚类图,差异蛋白筛选标准为Foldchange≥1.5倍(Foldchange是评估某一蛋白在样品间表达水平变化倍数);

(b)肉芽肿坏死组织(橙色圆圈)和活性组织(绿色方块)的主成分分析(PCA);

(c)富集到的GO功能和KEGG通路的差异蛋白在坏死组织与活性组织的分布-散点图(肉芽肿坏死组织(橙色圆圈)和活性组织(绿色圆圈));

(d)促炎症蛋白和抗炎症蛋白层次聚类热图。

(e)白三烯和脂素合成途径的蛋白质组学分析。为了进行统计分析,测试并计算了以下两组(注释类别对应的蛋白质与数据集中所有蛋白质)的中位数之间的差异。使用双边Wilcoxon-Mann-Whitney检验对每个注释术语进行了检验,其中多假设检验通过采用benjamin - hochberg FDR阈值0.05进行调整。


3.免疫组化(IHC)+空间代谢组学检测肉芽肿

通过前面的Label free蛋白质组学研究发现坏死组织中含有丰富的磷脂酶A2激活蛋白(PLAA),并且利用免疫组化(IHC)和共聚焦显微镜在坏死组织中定到多个磷脂酶,这些酶能激活参与合成二十烷类前体-花生四烯酸。尽管生物合成酶的存在表明它们的最终产物可能会积累,但磷脂酶和产物的丰度可能不相关,因为酶的活性有多种调节方式。


为了验证二十烷类的存在,研究人员使用空间代谢组学技术直接测量AA的丰度(图3a)。在人活性、干酪性和空腔性肉芽肿中对AA及其前体进行了成像,发现它们的丰度模式与蛋白质组学分析确定的代谢AA的蛋白质表达一致。检测结果表明:正常肺组织中AA表达量很少,病变肉芽肿组织中AA表达量相对较高,且在坏死边界组织中显著富集(图3b)。随后,兔子活性组织和坏死组织的空间代谢组学显示出与人肉芽肿相似的AA分布模式(图3c)

图3 | AA丰富且在所有肉芽肿中弥漫性合成


(a)空间代谢组学和LC-MS对解剖病灶中膜磷脂和AA的定量工作流程。

(b) 空间代谢组学分析人体组织中含有AA的脂类和AA。来自六个不同的受试者的三个空洞和三个干酪样肉芽肿的图像,并显示了每个类型的一个代表性病变。最左边的图像是具有代表性的HE和e染色组织。

(c)兔组织中含aa脂质的空间代谢组学分析。对4只家兔的2个实性肉芽肿和2个干酪性肉芽肿进行了成像,并分别显示了各类型的代表性病变。在b,c,比例尺,5毫米;彩色条显示图像强度范围从蓝色(最低)到红色(最高)。


4. 肉芽肿中心坏死组织的促炎症反应研究

白三烯A4水解酶(LTA4H)是代谢花生四烯酸(AA)的蛋白质,能够促进炎症反应的发生,且与TNF-α的产生有关(图4a)Label free蛋白质技术研究发现,空洞肉芽肿病变组织和干酪肉芽肿病变组织边缘有较多的LTA4H(图4b和补充图4),实性肉芽肿中LTA4H很少(图4b,c)。免疫组化分析结果显示:TNF-α在实性肉芽肿中含量相对较少(图5a),在干酪样肉芽肿和空腔肉芽肿坏死边缘含量较高(图5b、c和补充图5a)。以上研究结果表明:TNF-α染色显示分布与LTA4H相似,共定位率为85.3%,而且LTA4H和TNF-α的共定位在兔子的实性和干酪性病变样本中再次出现(图5d)。这些结果表明,LTA4H介导的促炎症反应与TNF-α的产生有关。可以推断出,在肉芽肿坏死的区域,这种促炎症细胞因子会更丰富。

图4 | 白三烯生物合成在坏死和直接毗邻坏死组织的细胞层中富集


(a)AA是促炎白三烯(左)或促炎前列腺素(右)的前体;

(b)实性肉芽肿(左)和干酪样肉芽肿(右)中LTA4H(绿色)、DAPI(蓝色)细胞核和IBA1(青色)巨噬细胞H&E染色或免疫组化分析的代表图像;

(c)肉芽肿中LTA4H荧光平均定量;

(d)LTA4H荧光定量作为与巨噬细胞边界距离的函数(n=5);

(e)左图,典型干酪样肉芽肿细胞亚型中LTA4H荧光相对强度的代表性图像(n=7)。定量实性肉芽肿(n=8)(左),干酪性肉芽肿(n=7)(中)和空洞性肉芽肿(n=7)(右)不同区域的LTA4H强度。有关区域如何划分的解释,请参见在线方法中的免疫组化部分。误差柱代表平均值±标准差。在b,e,刻度柱中,350µm。为了定量免疫组化图像中的荧光平均强度(c,e),对单个比较进行了学生t检验。对于多次比较,均值差异采用非参数Kruskal-Wallis分析进行检验,并使用Bonferoni-Dunn校正进行校正。P<0.05被认为是显著的。

图5 | TNF-α和LTA4H在坏死组织及其边缘分布更丰富


(a)免疫组化分析TNF-α(红色)、LTA4H(绿色)、DAPI(蓝色)和IBA1(青色)细胞核的图像;可视化巨噬细胞)代表人类固体肉芽肿(n=1);

(b)包含IHC分析一个代表人类干酪样肉芽肿(n=4);

(c)包含IHC分析一个代表人类腔的肉芽肿(n=3);

(d)包含IHC分析肿瘤坏死因子-α(红色),LTA4H(绿色),核用DAPI(蓝色),IBA1(青色)在典型的兔干酪性肉芽肿中(n=2)


5. LC-MS靶向代谢组学验证-肉芽肿周围活性组织的抗炎症反应研究

与坏死肉芽肿中心组织相比,周围组织表现出更多的抗炎特征,抗炎调节剂和还原剂在肉芽肿周围组织中富集(图2d)。在二十烷类通路中,前列腺素合成可缓和结核病变中的炎症(图6a)空间代谢组学与免疫组化研究结果显示:前列腺素内过氧化物合酶1(前列腺素G/H合酶和环氧化酶)(PTGS1;PTGS2(也称为COX1)和PTGS2(也称为COX2)在实性肉芽肿中丰富,与肉芽肿整体炎症特征较低一致(图6b)


LC-MS靶向代谢组学数据分析,前列腺素6-keto-PGF1α在活性组织中表达更丰富(图6c)。在空洞型和干酪型肉芽肿中,发现COX1和COX2均在周围活性组织层中广泛表达,但在坏死的组织中基本不表达(图6d,e)。这与LTA4H丰度的模式形成了对比。LTA4H是由巨噬细胞亚群特异性表达的,但研究发现COX1和COX2在巨噬细胞和成纤维细胞中都有表达(图6f)。在兔组织中,发现COX1和COX2在肉芽肿周围组织区表达更丰富,这与人类的观察结果类似(图6g,h和补充图6d)。因此,各种二十烷类化合物(白三烯)的相对丰度表明,肉芽肿坏死中心的周围组织中有一个高度抗炎症的分子环,包括COX1和COX2通路的一些前列腺素,可以缓解炎症。

图6 | COX1和COX2在所有肉芽肿区域均呈弥散表达


(a)以AA为前体的前列腺素合成途径中的COX1和COX2示意图。5-LO 5-lipoxygenase;PGDS:前列腺素D合成酶;前列腺素E合成酶(PGES);PGD2,前列腺素D2;PGE2,前列腺素E2;PGF2,前列腺素F2。

(b)肉芽肿中COX1和COX2荧光定量(每组n = 5);

(c)肉芽肿干酪和细胞区前列腺素6-keto-PGF1α的脂质定量(每组n = 5)。在b,c中,误差柱代表平均值±标准差,对单次比较进行学生t检验。对于多次比较,均值差异采用非参数Kruskal-Wallis分析进行检验,并使用Bonferoni-Dunn校正进行校正。* P < 0.05;* * P < 0.01;n,不重要。

(d)实性肉芽肿(上)和干酪样肉芽肿(下)中COX1(绿色)或COX2(绿色)、DAPI(蓝色)和IBA1(青色)的H&E染色或免疫组化分析的代表性图像。

(e) COX1和COX2荧光作为与巨噬细胞边界距离的函数(每组n = 5)。

(f)肉芽肿内细胞亚型COX1和COX2的平均荧光强度(每组n = 7)。罗马数字表示图例中标记的单元格类型。误差线代表的意思是南达科他州±。

(g, h)代表包含IHC分析COX1(绿色)、肿瘤坏死因子-α(红色),核用DAPI(蓝色)和IBA1巨噬细胞(青色)细胞和坏死区域的兔子干酪样肉芽肿(g)或在一只兔子细胞地区固体肉芽肿(h)每组(n = 2)。在d,g,h,标尺,350µm。


研究结论



综上所述,肉芽肿中心坏死组织有一个促炎症环境。相反,肉芽肿周围的活性组织具有相对消炎的特征,这些特征在人和兔子样本中一致,即宿主抑制结核分枝杆菌和限制宿主损伤的能力是一种局限于单个肉芽肿水平的现象。当然,肉芽肿之间的细菌负荷和免疫激活存在显著差异,即使在同一宿主内也是如此。尽管此结果需要在更大的样本集中得到证实,但本文空间代谢组学+多组学技术研究数据表明,真正的平衡发生在局部,系统性干预可能相当复杂。


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