恭喜 | 浙江大学药学院何俏军、罗沛华团队自噬诱导心肌细胞死亡机制喜发生物一区顶刊

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2021年8月，浙江大学药学院何俏军、罗沛华团队在Autophagy期刊发表了题为“Autophagic degradation of CCN2 (cellular communication network factor 2) causes cardiotoxicity of sunitinib”的研究成果，通过动物模型、功能实验、iTRAQ蛋白质组学等研究方法，发现了舒尼替尼诱导的自噬导致心肌细胞凋亡和心脏功能障碍，探究了舒尼替尼诱导的适应不良自噬通过TOLLIP介导的内体相关通路选择性降解心肌细胞存活介质CCN2的机理，揭示了调节心肌细胞死亡的自噬降解新靶标蛋白。为提高基于舒尼替尼的癌症治疗安全性提供了方法及理论依据。

心肌细胞死亡是心血管疾病和心脏毒性的主要病理生理原因。过度自噬是心肌细胞死亡的已知原因之一，然而也有研究表明自噬在压力响应中对心脏具有保护作用。因此必须精确调节自噬活动以维持心脏稳态。临床数据显示，使用舒尼替尼作为癌症治疗的患者可能会发生心力衰竭。即使在终止使用舒尼替尼后，大多数患者也不能完全逆转，这限制了其临床应用。已有报道表明自噬激活和抑制都可能导致舒尼替尼治疗后大鼠H9c2心肌细胞或周细胞的死亡[1,2]。然而尚缺乏对舒尼替尼治疗后心肌细胞自噬流的精确评估。

HMGB1是一种DNA结合核蛋白，对于协调自噬反应很重要。增加的细胞质或核HMGB1表达会通过不同通路促进自噬进展。此外，已有报道表明HMGB1是心肌缺血/再灌注损伤、心力衰竭和蒽环类药物诱导的心肌病的关键介质。本文作者之前发现舒尼替尼可以在癌细胞和非癌细胞中诱导HMGB1从细胞核到细胞质的转变，并促进TP53/p53的自噬降解[3]。然而，HMGB1是否在桥接舒尼替尼诱导的自噬、心肌细胞死亡和心脏毒性方面发挥作用尚不清楚。

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1. 舒尼替尼导致心肌细胞死亡和心脏损伤

心血管毒性是与舒尼替尼在抗癌治疗中的临床应用相关的最紧迫问题。作者先前的体外研究表明舒尼替尼治疗会导致心肌细胞自噬和随后的死亡。舒尼替尼降低了CCC-HEH-2、MCM、H9c2和NRVM的存活比例（图1A）。Western blot结果表明舒尼替尼显著增强了细胞凋亡标志物c-PARP和caspase 3的表达（图1B，C）。细胞核的DAPI染色显示了舒尼替尼处理的MCM和CCC-HEH-2细胞中的核浓缩（图1D），表明发生了细胞凋亡。舒尼替尼治疗以时间依赖性方式显著促进CCC-HEH-2细胞的凋亡（图1E）。泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK挽救了由舒尼替尼引起的CCC-HEH-2细胞死亡和凋亡（图1F）。这些结果表明舒尼替尼促进心肌细胞凋亡，这可能是其心脏毒性的关键原因。

为了更清楚地了解心肌细胞死亡和毒性，作者评估了舒尼替尼在体内（肾细胞癌的小鼠异种移植模型）的心脏毒性和抗癌活性之间的关系。通过H&E染色对舒尼替尼治疗的小鼠心脏进行组织学分析，发现细胞质丢失（细胞质空泡化）和肌原纤维解体，表明存在心肌细胞死亡（图1G）。共聚焦显微镜检查表明舒尼替尼促进了心脏心肌细胞的凋亡。这些体内研究表明，舒尼替尼治疗的小鼠在发挥抗癌活性时表现出轻微的心脏毒性。

图1 | 舒尼替尼诱导心肌细胞凋亡和心脏毒性

2.不适应的自噬促进舒尼替尼的心肌细胞凋亡和心脏毒性

由于已经证实自噬促进了舒尼替尼诱导的体外心肌细胞死亡，作者接下来测试了舒尼替尼治疗小鼠心脏组织中自噬的激活。MAP1LC3/LC3-II的水平是公认的自噬活性标志物，其响应体内舒尼替尼治疗而上调（图2A）。此外作者进行了LC3-II表达分析，以检测体外在不同浓度舒尼替尼治疗中随时间推移的自噬激活。在舒尼替尼治疗后，CCC-HEH-2和MCMs细胞中的LC3-II表达以时间和浓度依赖性方式显著增加（图2B）。免疫组化和免疫荧光也发现舒尼替尼治疗的心脏或心肌细胞中LC3斑点的积累增加（图2C-E）。图2(F,G)表明舒尼替尼刺激下自噬过度激活。

图2 | 舒尼替尼激活心肌细胞的自噬

接下来作者评估了自噬在舒尼替尼诱导的心肌细胞凋亡和心脏毒性中的作用。ATG5和ATG7对于ATG结合系统和自噬体形成都是必不可少的。作者使用siRNA来沉默ATG7或ATG5基因的表达，发现舒尼替尼诱导的c-PARP、c-CASP3和LC3-II表达增加（图3A，B）及细胞死亡（图3C）被逆转，表明抑制自噬挽救了心肌细胞的凋亡，支持心肌细胞自噬有助于凋亡的假设。

然后作者检查了自噬在舒尼替尼诱导的体内心脏毒性中的作用。Atg7flox/flox小鼠与Myh6-MerCreMer小鼠杂交，以在成人心脏中诱导敲除Atg7（图3D）。在他莫昔芬诱导后，蛋白质印迹分析证实了与来自Atg7-/+小鼠的肝、肺、肾或脾相比，心脏中Atg7敲低的特异性（图3E）。如图3F所示，舒尼替尼诱导的LC3-II增加被下调，这意味着从LC3-I到LC3-II的转化被阻断，表明舒尼替尼诱导的自噬显著减少。Atg7杂合子破坏减轻了舒尼替尼引起的心脏重量:体重比值的降低（图3G）。舒尼替尼引起的LV功能损害可以通过Atg7杂合子破坏得到改善（图3I-J）。组织学分析显示，与舒尼替尼治疗下的Atg7f/+小鼠相比，Atg7-/+小鼠的心脏损伤特征显著降低（图3K）。因此，这些数据支持不适应的自噬在舒尼替尼诱导的体内心脏毒性中的有害作用。

图3 | 自噬导致舒尼替尼的心脏毒性

3.CCN2的减少导致自噬依赖性心脏毒性

据报道，致死性自噬性死亡可能归因于线粒体或生存相关蛋白的过度消除。实验表明舒尼替尼的自噬促进心脏毒性与线粒体损伤和降解无关。因此作者推测自噬可能会引起重要的细胞内蛋白质的降解，进而促进心肌细胞死亡。为了鉴定自噬的靶蛋白，作者使用pepstatin A和E-64d来阻止溶酶体降解，并使用蛋白质组学技术分析溶酶体中的富集蛋白质。与对照组相比，舒尼替尼、pepstatin A和E-64d处理的心肌细胞中约60种蛋白质显著上调，其中CCN2的水平增加了5倍。因此作者推测舒尼替尼可能促进溶酶体中CCN2的聚集以进行自噬降解。验证实验发现舒尼替尼治疗降低了CCC-HEH-2细胞（图4A-C）和心脏组织（图4D）中的CCN2蛋白丰度。

为了证明CCN2减少与自噬依赖性心脏毒性之间的关系，作者首先确认了CCN2减少在心肌细胞死亡中的作用。心肌细胞被两种具有不同序列的靶向CCN2的shRNA感染。CCN2的敲低增加了c-PARP和c-CASP3的蛋白质水平，并导致CCC-HEH-2细胞死亡（图4E），但未能影响LC3水平。表明CCN2的水平与细胞凋亡有关，但不是自噬的原因。接着作者发现CCN2的敲低显著增加了CCC-HEH-2细胞的凋亡率（图4F）。如图4G所示，AAV9-Tnnt2-Ccn2-null注射小鼠心脏切片中的Ccn2表达几乎消失。Ccn2的敲低导致HW:BW比率下降（图4H）。此外通过Ccn2的敲低，EF、FS和心率显著降低（图4I-J）。H&E和Sirius Red染色显示AAV9-Tnnt2-Ccn2-null注射小鼠的肌原纤维解体和轻微纤维化（图4K-L）。研究结果表明CCN2是心脏功能和体内平衡所必需的。

图4 | 不适应的自噬通过降解CCN2促进舒尼替尼的心脏毒性

然后作者通过使用AAV9-Tnnt2-Ccn2病毒过表达Ccn2验证了这一结论（图5A-B）。心脏组织的蛋白质印迹分析表明，AAV9-Tnnt2-Ccn2病毒对Ccn2的过表达减轻了舒尼替尼诱导的CCN2减少（图5C）。Ccn2的过表达抑制了舒尼替尼诱导的HW:BW比率降低（图5D）。此外，降低的EF和FS被Ccn2的过表达所挽救（图5E-G），表明LV功能障碍的缓解。舒尼替尼诱导的CK-MB和TNNT2血清水平升高被逆转（图5H）。组织学分析显示，与用舒尼替尼治疗的AAV9载体注射小鼠相比，暴露于舒尼替尼的AAV9-Tnnt2-Ccn2注射小鼠的心脏损伤有所缓解（图5I）。这些结果表明，舒尼替尼引发的自噬促进心脏毒性主要取决于CCN2的下调。

图5 | Ccn2的过表达挽救了舒尼替尼引起的心脏毒性

4. 舒尼替尼诱导的自噬促进CCN2的降解

为了确定舒尼替尼介导的CCN2下调的机制，作者使用了一种蛋白质合成抑制剂CHX来检测CCN2蛋白质周转。结果表明舒尼替尼治疗导致CCN2半衰期缩短（图6A），证实CCN2蛋白水平降低是由于降解增加。除了自噬-溶酶体通路外，细胞内蛋白质水平也受泛素-蛋白酶体系统调节。因此作者研究了这两个系统在舒尼替尼诱导的CCN2降解中的作用。MG132对蛋白酶体降解通路的抑制未能抑制舒尼替尼诱导的CCN2降解，而氯喹（CQ）对溶酶体功能的阻断完全逆转了舒尼替尼诱导的CCN2表达降低（图6B）。这些结果进一步表明，舒尼替尼诱导的CCN2降解需要溶酶体而不是蛋白酶体。此外作者发现ATG5的敲低逆转了CCN2的减少（图6C）。对舒尼替尼处理的Atg7f/+和Atg7-/+小鼠心脏组织的蛋白质印迹分析表明，敲低Atg7减轻了CCN2的下调（图6D）。免疫荧光分析表明，在舒尼替尼加CQ处理后，CCN2与CCC-HEH-2细胞核周围的LC3共定位，表明CCN2被封闭在自噬体中（图6E）。

接着作者使用蛋白质组数据分析了自噬货物受体，以进一步证实CCN2的自噬降解。发现只有TOLLIP敲低显著抑制了舒尼替尼诱导的CCN2自噬降解（图6F），表明TOLLIP可能是溶酶体中CCN2降解的自噬货物受体。免疫沉淀实验发现舒尼替尼增强了CCN2和TOLLIP之间的相互作用（图6G），表明TOLLIP参与了舒尼替尼诱导的CCN2自噬降解。此外作者还观察到部分CCN2和CD63是共定位的（图6H），进一步表明CCN2可能被TOLLIP介导的内体相关自噬通路降解，从而导致心肌细胞凋亡和心脏功能障碍。

图6 | 舒尼替尼通过自噬-溶酶体通路促进CCN2蛋白的降解

5. 累积的核HMGB1对于舒尼替尼激活的自噬和心脏毒性至关重要

根据上述结果，作者推测抑制自噬启动可能是对抗舒尼替尼诱导的心脏毒性的一种可能策略。已有报道表明HMGB1在自噬和心血管疾病的调节中起着关键作用。因此作者关注HMGB1在舒尼替尼自噬依赖性心脏毒性中的作用。蛋白质印迹分析显示HMGB1蛋白水平在舒尼替尼治疗的心肌细胞（图7A）和舒尼替尼治疗小鼠的心脏组织（图7B）中增加。

免疫荧光分析显示，舒尼替尼促进了心脏切片中CCC-HEH-2细胞或心肌细胞中HMGB1的核积累（图7C）。值得注意的是，siRNA对HMGB1的敲低降低了舒尼替尼增强的自噬流（图7D），表明HMGB1可能参与舒尼替尼引起的心脏毒性中的心肌细胞自噬。为了更精确地探索HMGB1在自噬相关心肌细胞死亡中的作用，作者使用CRISPR-Cas9来敲除CCC-HEH-2细胞中的HMGB1表达。在HMGB1 KO细胞中，舒尼替尼对LC3-I/II或PARP激活没有明显影响（图7E）。HMGB1敲除显著挽救了心肌细胞死亡（图7F）。总的来说，结果表明HMGB1是舒尼替尼诱导的自噬和细胞凋亡的潜在主要调节因子。

组织学分析显示，与舒尼替尼治疗下的野生型小鼠相比，hmgb1 cKO小鼠的心脏损伤有所减轻（图7G）。如图7H所示，舒尼替尼引起的HW:BW比值下降被hmgb1敲除所挽救。此外，hmgb1缺失可以缓解舒尼替尼受损的LV功能（EF和FS）（图7I，J）。心脏切片中的免疫荧光测定也显示舒尼替尼治疗后hmgb1 cKO小鼠的c-CASP3水平降低（图7K），表明心脏特异性hmgb1缺失抑制了舒尼替尼引起的细胞凋亡。值得注意的是，舒尼替尼诱导的CCN2减少和LC3-II增加在hmgb1 cKO心脏中被逆转（图7L），表明舒尼替尼诱导的自噬和CCN2降解因hmgb1缺失而显著降低。这些数据确定了核HMGB1在体内舒尼替尼的自噬依赖性心脏毒性中的主要作用。

图7 | 舒尼替尼诱导的过量HMGB1诱导适应不良的自噬和随后的细胞凋亡

6. 抑制HMGB1通过阻断CCN2降解赋予功能保护免受舒尼替尼诱导的心脏毒性

上述发现表明HMGB1可能是治疗舒尼替尼心脏毒性的可靠靶点。先前的研究报道，甘草酸（GA）可以抑制HMGB1的表达。本文发现GA以浓度依赖的方式下调HMGB1的表达（图8A）。因此作者假设GA可以通过抑制HMGB1来阻断舒尼替尼诱导的CCN2自噬降解。首先，GA明显抑制了舒尼替尼诱导的LC3-II和CCN2降解（图8B）。此外GA抑制了舒尼替尼诱导的MCM和CCC-HEH-2细胞中的自噬流（图8C）。GA显著抑制了c-PARP和c-CASP3的增加（图8D）并改善了心肌细胞存活率（图8E，F）。作者确认了GA对舒尼替尼引起的异常HW:BW比率的修复作用（图8G）。GA还降低了由舒尼替尼引起的异常升高的血清CK-MB和TNNT2水平（图8H）。GA使减少的EF和FS值恢复到正常水平（图8I），表明GA可以治疗舒尼替尼刺激的心脏功能障碍。H&E染色显示GA挽救了由舒尼替尼引起的细胞质空泡化（图8J）。这些结果表明GA通过阻止HMGB1介导的CCN2自噬降解在舒尼替尼诱导的心脏毒性中发挥保护作用。

图8 | GA对HMGB1的抑制赋予了针对舒尼替尼诱导的心脏毒性的功能保护

过度自噬是心血管疾病或癌症治疗引起心肌细胞死亡的原因之一，但其潜在机制尚不清楚。先前报道自噬可能导致舒尼替尼引起的心肌细胞死亡，这可能有助于理解自噬诱导的心肌细胞死亡的机制。本文发现舒尼替尼诱导的自噬导致心肌细胞凋亡和心脏功能障碍。舒尼替尼诱导的适应不良自噬通过TOLLIP介导的内体相关通路选择性降解心肌细胞存活介质CCN2。值得注意的是，Hmgb1的缺失抑制了舒尼替尼诱导的心肌细胞自噬和凋亡，而HMGB1特异性抑制剂甘草酸（GA）显著减轻了舒尼替尼诱导的自噬、心肌细胞死亡和心脏毒性。本文研究揭示了调节心肌细胞死亡的自噬降解新靶标蛋白，并强调了HMGB1的药理学抑制剂作为提高基于舒尼替尼的癌症治疗安全性的有吸引力的方法。

本文研究结果加深了人们对药物诱导的心脏功能障碍中自噬细胞死亡机制的理解，并揭示了选择性靶向CCN2促进心肌细胞自噬降解会导致舒尼替尼刺激的心肌细胞凋亡和心脏毒性。本文是典型的机制研究类文章，其中蛋白质组学技术鉴定了关键的靶蛋白，是机制研究的有利工具。

参考文献：

[1] Zhao YQ, Xue T, Yang XC, et al. Autophagy plays an important role in Sunitinib-mediated cell death in H9c2 cardiac muscle cells. Toxicol Appl Pharm. 2010;248:20–27.

[2] Kimura T, Uesugi M, Takase K, et al. Hsp90 inhibitor geldanamycin attenuates the cytotoxicity of sunitinib in cardiomyocyte via inhibition of the autophagy pathway. Toxicol Appl Pharm. 2017;329:282–292.

[3] Luo PH, Xu ZF, Li GQ, et al. HMGB1 represses the anti-cancer activity of sunitinib by governing TP53 autophagic degradation via its nucleus-to-cytoplasm transport. Autophagy. 2018;14 (12):2155–2170.

[4] Zhifei Xu et al. Autophagic degradation of CCN2 (cellular communication network factor 2) causes cardiotoxicity of sunitinib. Autophagy. 2021 Aug 25;1-22.

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云起撰文

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