项目文章 | 南中医吴颢昕团队发现中药泽泻饮可通过调节肠道菌群治疗动脉粥样硬化

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2020年9月，南京中医药大学吴颢昕课题组在Frontiers in Pharmacology发表了题为“Alisma orientalis Beverage Treats Atherosclerosis by Regulating Gut Microbiota in ApoE-/-Mice”的研究成果，通过以高脂饮食（HFD）喂养的载脂蛋白e缺失（ApoE-/-）雄性小鼠建立AS模型，并对其炎症因子和血清生化指标进行评估。通过LC-MS靶向代谢组学评估AOB喂养小鼠血清中的TMAO和TMA水平，利用Western Blotting评估FMO3在肝蛋白表达量，采用16S rRNA测序技术建立微生物群结构的变化，评估泽泻饮对HFD小鼠的治疗效果。为泽泻饮治疗动脉粥样硬化提供了理论参考。

动脉粥样硬化（AS）是较为广发的疾病，因其可以导致心肌梗死和中风等心脑血管疾病，具有较高的死亡率。AS的产生与不良饮食习惯密切相关，而肠道菌群参与了AS的形成过程。膳食分子通过肠道菌群的作用转化为三甲胺（TMA），再通过肝黄素单加氧酶（FMO）转化为三甲胺氧化物（TMAO）。FMO3是FMO家族的主要成员，抑制FMO3可以显著降低TMAO水平和AS。TMAO作为肠道微生物衍生代谢物，被认为是AS发展为心血管疾病（CVD）的预后标志物。

泽泻饮（AOB）由泽泻、白术与鹿衔草三种草药按照２∶２∶１的比例配制而成，具有干扰脂质代谢、减少动脉粥样硬化的作用，常被用于治疗代谢综合征和动脉粥样硬化。但目前对AOB的生物学研究有限，AOB治疗AS的机制需进一步研究。

1、常规指标分析：AOB对脂肪组织比例、体重及血脂水平的影响

小鼠8周的体重变化并不明显，但各组的脂肪与体重的比例显著低于HFD组（图1,2）。与NC组相比，HFD组血清TC（NC：3.56±0.62 m mol/l，HFD：44.07±2.39 m mol/l）、TG（NC：1.69±0.26 m mol/l，HFD：5.89±0.59 m mol/l）、LDL-C（NC：1.84±0.29 m mol/l，HFD：9.81±0.47 m mol/l）和HDL-C（NC：1.62±0.31 m mol/l，HFD：8.75±0.72 m mol/l）显著升高（P<0.001，图1C-F）。AOB或阿托伐他汀治疗后血清TC（AOBH：32.05±3.47 m mol/l，Ato：30.31±4.67 m mol/l）、TG（AOBH：4.60±0.36 m mol/l，Ato：4.18±0.85 m mol/l）和LDL-C（AOBH：7.87±0.53 m mol/l，Ato：8.36±0.32 m mol/l）显著降低（P<0.05，图 1C-F）。Abs组血脂生化水平无明显变化，作为Abs组联合AOB干预治疗的AbsA组TC（AbsA：36.39±3.51 m mol/l）水平显着降低（P<0.05，图1C）。

图1 | AOB对脂肪组织比例、体重及血脂水平的影响

2.常规指标分析：AOB对HFD诱导的动脉粥样硬化的衰减作用

通过主动脉根部横断面病变的组织学检查评估AOB对斑块形成的治疗影响。同时，使用堵塞区域的放大图像，作者观察到染色的斑块中的脂质和泡沫细胞比其他组更密集（图2A）。在HFD（361854.66±132598.21 mm2）和Abs组（349267.83±121761.48 mm2）中清楚地观察到严重的血管堵塞，而其他治疗组的主动脉堵塞较少（P<0.05，图2B）。由于主动脉横截面的所有根部的大小或直径都不相同，作者分析了斑块面积相对于血管腔面积的百分比。HFD（24.57±7.18%）与Abs组的平均斑块面积（22.82±3.44%）没有显著差异（P>0.05，图2B）。此外，在AOBH（1.64±1.05%）和Abs（1.50±0.77%）组的主动脉切片中，斑块面积与血管腔面积的百分比显著降低（P<0.01）。AOBL（4.67±0.65%）和AbsA（6.89±1.05%）组的百分比也下降（P<0.05）。

图2 | AOB对动脉粥样硬化病变的影响

3.AOB对血清全身炎症细胞因子水平的影响

为了确定AOB对减少慢性炎症反应的全身作用，进行了多细胞因子测定以检查与动脉硬化相关的主要血清炎症细胞因子的水平。服用HFD的小鼠白细胞介素10（IL-10）、肿瘤坏死因子白介素6（IL-16）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素1-β（IL-1β）和白细胞介素17（IL-17）含量显著高于NC组（P<0.001，图3A）。当给予抗生素时，这些血清全身炎症细胞因子水平没有降低，但它们在AOB和阿托伐他汀治疗组中显著降低（P<0.001）。与HFD组相比，AOB组下降最明显的是TNF-α（HFD：6.77±0.34 pg/ml，AOBH：1.77±0.08 pg/ml）、IL-1β（HFD：61.79±1.38 pg/ml）/ml，AOBH：45.27±1.75 pg/ml）、IL-16（HFD：71.85±1.86 pg/ml，AOBH：9.45±1.45 pg/ml）、IL-10（HFD：11.17±0.58 pg/ml，AOBH：4.07±0.28 pg/ml）和IL-17（8.84±0.51 pg/ml，AOBH：6.76±0.28 pg/ml）（图3B-F）。IFN-γ仅在AOB组中有下降趋势（HFD：3.08±0.84，AOBH：2.16±0.19）（P<0.1，图3A、G），但这种趋势不构成统计学意义。

图3 | AOB对血清细胞因子和趋化因子水平的影响

4.AOB治疗后肝脏FMO3表达和血清TMAO水平降低

血清TMAO主要由肝脏FMO3从TMA转化为肝脏形成，因此，作者研究了AOB是否会改变FMO3肝脏表达量。研究发现HFD、Abs和Ato组的FMO3水平没有显著差异，但AOB治疗组的FMO3水平（HFD：1.28±0.11倍，AOBH：0.92±0.09倍，AOBL：0.93±0.06倍）显著降低（P<0.01），抗生素干预联合AOB治疗后FMO3水平也降低（AbsA：0.99±0.13倍）（P<0.05，图4A）。然后作者还研究了AOB最小化体内TMA和TMAO的能力，分析表明，AOB患者肝脏中减少了TMAO（HFD：324.09±64.21ng/ml；AOBH：175.18±25.84ng/ml）的积累（P<0.01，图4B-D）。这一发现表明AOB影响肠道微生物群，同时调节肝脏中FMO3的表达并降低体内TMAO浓度。

图4 | AOB影响肝脏FMO3，从而降低ApoE-/-小鼠血清TMA和TMAO水平

5.16S rRNA测序：AOB介导的微生物多样性变化在动脉粥样硬化发展中的作用

为了分析AOB处理对肠道微生物群组成的影响，作者对30个样本的1437216个clean reads进行了测序。每个样品内的曲线在香农稀疏图（图5A）中几乎是平坦的，表明测序范围能够确定整个标本的生物多样性。Abs组的曲线纵坐标显著低于其他组，表明其包含的细菌多样性最低。alpha多样性的Chao指数表明，HFD的抗菌治疗显著降低了肠道微生物群的异质性（HFD：296.26±17.66 OTU，Abs：44.66±30.10 OTU）（P<0.001，图5B）。在使用AOB后，发现AOB重建了肠道微生物群并恢复了多样性。基于决定UniFrac距离的主要协调评估（PCoA）显示AbsA组的微生物群组成相对于Abs组有显著差异，与其他三组相比，差距缩小（R=0.7216，P=0.0010，图5C)，其他三组PCoA都不同。AOB治疗后HFD喂养小鼠的肠道微生物群与HFD组不同。用AOB治疗的组比HFD组具有更广泛分布的PCoa坐标（R=0.6461，P=0.0010，图5D）。这一发现表明AOB能够调节肠道微生物群的结构。

图5 | 分析不同组间肠道菌群的多样性

6、AOB改善动脉硬化的肠道核心菌群

使用LEfSe分析来突出导致肠道种群微生物群变化的细菌表型，并说明了50个具有重大差异的肠道细菌包层（图7A、B）。在AOBH组中，放线菌门（从门到属）被确定为最丰富的。此外，AOB还丰富了粪肠杆菌属和细杆菌属的LDA评分。在HFD组中，发现厚壁菌门、芽孢杆菌纲和乳杆菌目（从目到属）的LDA评分被丰富。此外，作者还检查了19个属，这些属被认为是导致LDA得分显著差异的主要属（图8A）。AOBH组与HFD组相比，发现乳酸杆菌（HFD：30.98±13.81%，AOBH：7.71±11.39%）、Turicibacter（HFD：12.52±9.09%，AOBH：7.25%）和粪杆菌真核菌属（HFD:0.31±0.24%,AOBH:0.17±0.16%），以及更高丰度的双歧杆菌（HFD:1.12±1.74%,AOBH:12.96±10.92%），Ileibacterium（HFD: 1.75±3.94%，AOBH：2.44±4.47%）和粪杆菌（HFD：0%，AOBH：0.0012±0.0019%）。

图6 | 相关门和属水平的细菌丰度

图7 | AOB对肠道菌群组成的影响

7、AOB改善动脉粥样硬化参数与核心肠道菌群的相关性

使用Spearman相关性分析（图8B）来研究一些动脉粥样硬化变量与肠道微生物群之间的关联。HFD组在乳杆菌和粪杆菌真核菌属中增强，与TC（Lactoba：0.69，Euba：0.62），TG（Lactoba：0.69，Euba：0.66），LDL-C（Lactoba：0.72，Euba：0.63）、主动脉病变（Lactoba：0.66，Euba：0.59）、IL-16（Lactoba：0.71，Euba：0.64）和TMAO（Lactoba：0.70，Euba：0.72）呈正相关。乳杆菌也与脂肪组织/体重比（0.87）、HDL-C（0.77）和IL-10（0.76）呈正相关。粪杆菌真核菌属也与IL-1-β（0.86）和FMO3（0.61）呈正相关。此外，AOB诱导的双歧杆菌和粪杆菌丰度的增加与脂肪组织/体重比（双歧杆菌：-0.69，粪杆菌：-0.58）、TG（双歧杆菌：-0.76，粪杆菌：-0.71），LDL-C（双歧杆菌:-0.72,Faecaliba:-0.79）,HDL-C（双歧杆菌:-0.73,Faecaliba:-0.82）,TNF-α（双歧杆菌:-0.69,Faecaliba:-0.64）,IL-1-β（双歧杆菌：-0.64，粪菌：-0.68），IL-16（双歧杆菌：-0.79，粪菌：-0.80），IL-10（双歧杆菌：-0.61，粪菌：-0.78），IL-17（双歧杆菌：-0.81，Faecaliba：-0.79）、FMO3（双歧杆菌：-0.59，Faecaliba：-0.68）和TMAO（双歧杆菌：-0.73，Faecaliba：-0.61）呈显著负相关。双歧杆菌也与TC（-0.84）呈负相关，Faecalibaculum与IFN-γ（-0.75）呈显著负相关。增加的回肠杆菌丰度与HDL-C（-0.63）、IL-16（-0.65）、IL-10（-0.64）和IL-17（-0.64）呈负相关。还发现TMA和Turicibacter与其他目标没有显著相关性。这些相关性的应用是模棱两可的，要显示因果关系需要进一步的实验。

图8 | AOB对动脉粥样硬化关键属及参数的影响

结果表明，AOB显著影响肠道微生物群，与体内肝脏FMO3和TMAO浓度的表达降低有关。减少循环TMAO可防止炎症细胞因子释放的诱导，并减少低度慢性全身炎症，最终降低由HFD引起的动脉粥样硬化的风险。

通过LC-MS靶向代谢、Western Blotting和16S rRNA测序等技术评估泽泻饮对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化治疗效果，发现AOB不仅能降低小鼠炎性细胞因子，还能改变肠道菌群、降低肠道菌群代谢产物TMAO含量。本研究为动脉粥样硬化治疗药物提供新的选择。

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 叮当  撰文

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