项目文章 | 上海交通大学潘秋辉团队发表N-豆蔻酰化在肝癌发生中的作用机制研究成果

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2021年5月欧易/鹿明生物客户上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心潘秋辉研究员课题组在Frontiers in Oncology期刊发表的题为“N-Myristoylation by NMT1 Is POTEE-Dependent to Stimulate Liver Tumorigenesis via Differentially Regulating Ubiquitination of Targets”的研究成果，通过蛋白质组学质谱鉴定、PRM靶向鉴定、iTRAQ标记定量蛋白组学等研究方法，发现了N-豆蔻酰化在肝脏肿瘤发生中发挥重要作用，揭示了NMT1的N-豆蔻酰化抑制抗肿瘤发生的NDP，并通过干扰泛素化来刺激促肿瘤发生的NUP机制。为靶向N-豆蔻酰化和NMT1可能有助于治疗肝癌提供了理论依据。

大多数成熟蛋白质行使正确功能需要翻译后修饰(PTM)。大量研究表明，PTM在调节各种生理和病理过程（例如蛋白质稳定性维持和肿瘤发生）中发挥着关键作用。与其他类型PTM相比，脂质修饰的研究较少。N-豆蔻酰化（N-myristoylation）是一种脂质修饰，其在癌症领域引起了关注。然而，肝癌细胞中的N-豆蔻酰化底物在很大程度上仍然未知。

N-豆蔻酰化可以由N-豆蔻酰转移酶(NMT)催化。迄今为止，已在哺乳动物中鉴定出两种NMT同工酶，即NMT1和NMT2。NMT丰度变化与多种癌症有关[1]，然而尚不清楚它是否与肝癌有关。N-豆蔻酰化和NMT是否影响肝癌发生以及相关机制仍知之甚少。

1.NMT1和N-豆蔻酰化促进转化表型

作者通过平行反应监测(PRM靶向验证)技术评估15种已知的蛋白质修饰酶在5对肝癌和正常肝组织中的表达水平。与正常肝脏相比，仅发现NMT1在肝癌中高度上调（图1A）。其中有几种酶可能由于丰度较低而没有检测到（图1A）。通过组织微阵列分析(TMA)，进一步证实了NMT1在肝癌中升高（图1B）。此外，整体N-豆蔻酰化和NMT1的水平不仅在临床肝癌标本中上调（与正常肝组织对比），而且在肝癌细胞系（SMMC-7721、HepG2、Bel-7402、Bel-7404、Huh7和SK-Hep1)中也上调（与肝细胞系THLE-3和HL-7702对比）（图1C）。

接着作者研究了NMT1和N-豆蔻酰化是否对肝脏肿瘤发生至关重要。敲除或过表达NMT1会抑制或刺激整体N-豆蔻酰化水平。敲低NMT1会减少细胞增殖、集落形成和体内肿瘤生长能力，而过表达NMT1会导致相反的效果。同时敲低NMT1产生的所有影响可通过过表达NMT1回复（图1D）。此外与对照小鼠相比，在肝脏条件敲除NMT1的小鼠中（NMT1-/-，NMT1flox/flox：Alb-Cre），观察到DEN/CCl4处理无法引起明显的肿瘤位点形成。而对NMT1条敲小鼠进行表达NMT1质粒的尾静脉注射后，则可检测到更大更多的肿瘤位点（图1E），表明NMT1是肝脏肿瘤发生不可或缺的基因。

图1 | NMT1和N-豆蔻酰化对肝癌至关重要

2.具有两种不同基序的蛋白质可以被N-豆蔻酰化

作者通过iTRAQ蛋白质组学技术鉴定敲低NMT1后发生变化的蛋白质。结果鉴定到三种上调蛋白(LXN, RPL29 and FAU)和六种下调蛋白（NMT1, MTPN, AHSG, ALB, GON7 and TF）（图2A）。作者将这些蛋白质分别命名为N-豆蔻酰化下调蛋白(NDP)和上调蛋白(NUP)。有趣的是，敲低NMT1会减少NDP和NUP的N-豆蔻酰化，而过表达NMT1会诱导NDP和NUP的N-豆蔻酰化（图2B）。在小鼠模型中，敲除NMT1会导致NDP和NUP的去N-豆蔻酰化，这可以通过在肝脏中表达外源性NMT1来部分逆转（图2C）。这些发现表明，尽管NMT1对NDP和NUP的表达起着相反的作用，但NMT1同时刺激NDP和NUP的N-豆蔻酰化。

接着作者试图揭示NDP和NUP之间的相似之处。结果发现了LXN、FAU和RPL29中的PxDQxxxxA（以下称为NDP基序）和TF、ALB和AHSG中的CxVxxxE（以下称为NUP基序）（图2D）。为了评估这两个基序的功能，作者构建了突变体，发现如果没有功能性NDP和NUP基序，NDP和NUP不能被N-豆蔻酰化（图2E）。

图2 | 两类NMT1靶标都可以被N-肉豆蔻酰化

3.NMT1通过NDP和NUP基序调节蛋白质稳定性

由于蛋白质修饰可通过影响其稳定性来影响蛋白质表达，作者假设N-豆蔻酰化和NMT1也会影响蛋白质稳定性。实验发现NMT1的过表达导致NDP的半衰期缩短（图3A），而NUP的半衰期延长（图3B）。然而，一旦NDP和NUP基序发生突变，NMT1就无法影响半衰期。与野生型相比，突变NDP的半衰期更长（图3C），而突变NUP的半衰期较短（图3D）。这些数据表明NMT1可能通过NDP和NUP基序对蛋白质稳定性进行相反调节。

图3 | NMT1反向调节NDP/NUP的半衰期

4.POTEE对NMT1介导的N-豆蔻酰化至关重要

接着作者研究了有助于控制N-豆蔻酰化和NDP、NUP表达的潜在因素。作者分别对LXN、RPL29、FAU、AHSG、ALB和TF进行免疫沉淀后做了质谱检测，发现32种蛋白质与NDP特异相互作用，而4种蛋白质与NUP特异相互作用。此外，32种蛋白质与NDP和NUP都发生相互作用（图4A）。为了缩减候选相互作用蛋白，作者查询STRING数据库发现只有RPL7A与NDP共同相互作用，并且只有HBB与NUP共同相互作用（图4A)。有趣的是，还鉴定到三个POTE家族成员(POTEE、POTEI和POTEJ)与NMT1相互作用（图4A）。通过公开的数据集发现只有POTEE在肝脏中明显表达，因此接下来作者主要关注POTEE。

作者研究了POTEE是否对NMT1介导的N-豆蔻酰化是必不可少的。结果发现敲低POTEE后整体N-豆蔻酰化显著减少，而过表达POTEE后会诱导N-豆蔻酰化。此外与对照相比，敲低POTEE几乎阻断了NMT1诱导的N-豆蔻酰化，而过表达POTEE可逆转此效果。与之相反，过表达POTEE增强了NMT1的效果（图4B）。除了整体N-豆蔻酰化，作者还分别评估了NDP和NUP的特定N-豆蔻酰化。与整体N-豆蔻酰化一样，POTEE对NMT1介导的NDP和NUP的N-豆蔻酰化是必不可少的（图4C）。这些结果表明POTEE增强了NMT1在刺激N-豆蔻酰化方面的功能。

此外，POTEE能够剂量依赖式的增强NMT1与NDP或NUP之间的相互作用。然而当NDP或NUP基序发生突变时，过表达POTEE仍然无法恢复NMT1和NDP或NUP之间的相互作用（图4D）。这些数据表明POTEE可能通过NDP和NUP基序加强NMT1与其目标之间的相互作用来发挥其积极作用。

图4 | POTEE对NMT1介导的N-豆蔻酰化至关重要

5.RPL7A和HBB通过影响泛素化调节NDP/NUP表达

尽管POTEE对NDP和NUP的N-豆蔻酰化产生积极影响，但NMT1和N-豆蔻酰化会导致NDP和NUP的相反结果。此外，NDP和NUP与RPL7A和HBB特异性结合。因此，作者假设NMT1和N-豆蔻酰化可能分别通过RPL7A和HBB反向调节NDP和NUP的表达。实验发现当敲低RPL7A或HBB时，NMT1过表达导致NDP下调及NUP上调的影响几乎被消除。通过同时过表达RPL7A或HBB（图5A、B）可以逆转这种影响。与之相反，过表达RPL7A或HBB会增强NMT1的效果（图5A、B）。有趣的是，RPL7A和HBB均不影响N-豆蔻酰化。这些数据表明RPL7A和HBB可能只是NMT1介导的靶标表达调节所必需的，而不是NMT1介导的N-豆蔻酰化所必需的。

因为NMT1影响NDP和NUP的蛋白质稳定性，作者假设RPL7A和HBB可能对这个过程很重要。实验表明过表达RPL7A导致NDP的半衰期缩短（图5C）。相比之下，过表达HBB导致NUP的半衰期延长（图5D）。此外，敲低RPL7A和HBB导致相反的结果。敲低RPL7A不仅降低了NDP泛素化的基础水平，而且还阻止了NMT1对NDP的进一步泛素化，而过表达RPL7A导致相反的结果（图5E）。敲低HBB会在基础水平诱导NUP泛素化，并阻止NMT1进一步抑制泛素化，而过表达HBB会导致相反的效果（图5F）。上述结果表明NMT1可能通过影响RPL7A和HBB的泛素化来调节NDP和NUP的表达。

图5 | RPL7A/HBB通过泛素化控制NDP/NUP表达

6.RPL7A和HBB通过HIST1H4H调节泛素化

由于尚未报告RPL7A和HBB与泛素化直接相关，因此作者研究了导致NDP和NUP泛素化的潜在因素。通过STRING数据库鉴定潜在的相互作用蛋白，发现六个(HSPA9、MYH14、HSPA8、HSPA1A、HIST1H4H、ACTB)与NDP和NUP相互作用的蛋白（图4A），也同时与RPL7A和HBB相互作用（图6A）。值得注意的是，只有HIST1H4H被预测具有类似于pfam13540基序的基序(pfam02291)。体内基于细胞的泛素化实验表明，敲低HIST1H4H导致NDP和NUP的去泛素化。体外泛素化实验表明纯化的NDP和NUP都可以被HIST1H4H泛素化。这些结果表明HIST1H4H可泛素化NDP和NUP。

基序分析在RPL7A和HBB中都鉴定了一个PPVxxAxxxxV基序（图6B），co-IP实验证实了外源性HIST1H4与RPL7A的相互作用，然而当HIST1H4H的pfam02291基序发生突变时，HIST1H4H和RPL7A之间的相互作用被阻断（图 6C）。如预期一样，HIST1H4H的pfam02291基序和HBB的PPVxxAxxxxV基序对于HIST1H4H和HBB之间的相互作用至关重要（图6C）。

接下来作者研究了HIST1H4H在NDP和NUP泛素化调控中的作用。发现过表达HIST1H4H导致NDP和NUP泛素化水平升高；然而当pfam02291基序发生突变时，这种效果就消失了（图6D）。此外过表达HIST1H4H增强的NDP泛素化可以被RPL7A剂量依赖性地刺激，但RPL7A中PPVxxAxxxxV基序的突变没有这种影响（图6D）。与之相关，HBB剂量依赖性地减少了HIST1H4H对NUP的泛素化。然而，没有PPVxxAxxxxV基序的HBB没有这种效果（图6D）。此外，作者测试了HIST1H4H、RPL7A和HBB对NDP和NUP表达的影响。结果发现在对照细胞中，过表达RPL7A抑制了NDP的表达，当敲低HIST1H4H时几乎可以消除这种影响，但恢复HIST1H4后可挽救这种影响（图6E）。类似地，敲低HIST1H4H阻止了HBB诱导的NUP升高，这也可以通过过表达HIST1H4H来恢复（图6E）。这些发现表明RPL7A和HBB可能通过影响HIST1H4H介导的NDP和NUP泛素化发挥其功能。

图6 | RPL7A和HBB通过HIST1H4H调节NDP和NUP

7.NMT1触发RPL7A和HBB以控制HIST1H4H

作者发现NDP/NUP基序的突变会阻断RPL7A/HBB结合NDP/NUP（图7A），表明除了N-豆蔻酰化以外，NDP/NUP基序也是结合RPL7A/HBB所必需的。此外，与RPL7A一样，一旦NDP基序发生突变，HIST1H4H就会与NDP解离；然而与HBB相反，NUP基序突变后HIST1H4H招募NUP（图7A），这表明NDP基序是招募HIST1H4H到NDP的关键，而NUP基序是HIST1H4H从NUP离解所必不可少的。

尽管无论NDP/NUP基序是否发生，HIST1H4H仍然能够刺激NDP/NUP的泛素化，而NDP/NUP的整体泛素化水平由NDP/NUP基序决定（图 7B），这表明NDP/NUP基序可能不是HIST1H4H的识别位点，而是调节HIST1H4H的活性。

由于NDP/NUP基序可被NMT1 N-豆蔻酰化，并且对于控制HIST1H4H是必不可少的，因此作者推测NMT1可能是调节HIST1H4H的关键。作者发现过表达NMT1剂量依赖性地增强HIST1H4H与NDP的结合，而抑制HIST1H4H与NUP的结合（图7C）。敲低NMT1导致了相反的结果（图7C）。与野生型小鼠肝脏相比，NMT1条敲小鼠肝脏中HIST1H4H与NDP的结合被抑制，而HIST1H4H与NUP的结合被刺激（图7D）。表达外源性NMT1可以逆转这种效果（图 7C、D）。

接着作者调查了RPL7A和HBB是否是HIST1H4H与NDP/NUP相互作用所必须的。结果发现RPL7A剂量依赖性地刺激HIST1H4H结合NDP，而HBB剂量依赖性的抑制HIST1H4H结合NUP（图7E）。然而当RPL7A和HBB的PPVxxAxxxxV基序突变后（图7E）这些效果消失。与此相反，敲低RPL7A减少了HIST1H4H与NDP的结合，而敲低HBB增加了HIST1H4H结合NUP（图7E）。作者还发现RPL7A不影响HIST1H4H结合NUP，HBB也不影响HIST1H4H结合NDP（图7E）。此外，敲低NMT1直接抑制RPL7A和HBB结合NUP和NDP（图7F），提示RPL7A和HBB的募集可能也通过NMT1来控制。

此外敲低POTEE后，过表达NMT1所引起的RPL7A募集到NDP及HBB到NUP都被废除（图7G）。敲低POTEE的效果可被异位表达POTEE挽救（图7G），表明POTEE对于NMT1调节RPL7A和HBB与NDP和NUP的相互作用是不可或缺的。

图7 | NMT1调节RPL7A和HBB以控制HIST1H4H

8.NMT1、NDP和NUP在肝癌中的临床意义

由于NMT1反向调节NDP和NUP的表达，并且NMT1可显著刺激肝脏肿瘤发生，因此作者假设NDP和NUP对肝脏恶性肿瘤的促进作用相反。实验发现敲低NDP会增加细胞增殖、集落形成和体内异种移植物生长的能力，并降低Caspase 3/7的活性。敲低NUP会导致相反的结果。这些结果表明NDP和NUP可能在维持转化表型方面发挥相反的作用。

iTRAQ标记定量蛋白组学技术鉴定AHSG和RPL29分别是上调和下调最显著的蛋白。301份肝癌标本的统计分析表明AHSG与NMT1呈正相关，而RPL29与NMT1呈负相关（图8A）。此外，NMT1和AHSG均与肿瘤分期正相关，而RPL29与肝癌的肿瘤分期呈负相关（图8B）。值得注意的是，NMT1和AHSG水平较高的肝癌患者的生存率低于水平较低的肝癌患者（图8C）。而较高水平的RPL29表明存活率较高（图8C）。这些数据表明NMT1、NUP和NDP与肝癌的临床结果密切相关。

图8 | NMT1、NDP和NUP的临床意义

大量研究表明，翻译后修饰在肿瘤发生过程中起着关键作用。与其他PTM相比，脂质修饰的研究较少。最近，一种脂质修饰N-豆蔻酰化在癌症领域受到关注。然而，N-豆蔻酰化如何在肝脏肿瘤发生中发挥作用仍不清楚。

本文通过平行反应监测（PRM靶向验证）评估成对组织中蛋白质修饰酶的表达；肝脏条件敲除NMT1小鼠模型评估N-豆蔻酰化在肝脏肿瘤发生过程中的关键作用；iTRAQ蛋白质组学技术鉴定NMT1敲除时发生变化的蛋白质；点击化学实验评估蛋白质的N-豆蔻酰化水平。结果发现N-豆蔻酰化及其酶NMT1在肝癌中起关键作用。NMT1的N-豆蔻酰化抑制了抗肿瘤发生的NDP，并通过干扰泛素化来刺激促肿瘤发生的NUP，最终导致促肝脏肿瘤发生的结果。靶向N-豆蔻酰化和NMT1可能有助于治疗肝癌。

蛋白质的翻译后修饰对于肝癌的肿瘤发生至关重要。本研究关注肝癌中N-豆蔻酰化的作用及机制，通过WB/IHC/IP等生化实验，结合蛋白质组学技术（iTRAQ标记定量蛋白组学和PRM靶向验证），证实了NMT1介导的N-豆蔻酰化在促进肝脏肿瘤发生中起关键作用，作用机制可能是通过控制泛素E3连接酶HIST1H4H的活性来干扰抗肿瘤NDP和促肿瘤NUP之间的平衡。并提出阻断N-豆蔻酰化可能有助于治疗肝癌。本文体现了蛋白质组学技术是研究机制的重要方法。

参考文献：

[1] Shrivastav A, Varma S, Senger A, Khandelwal RL, Carlsen S, Sharma RK. Overexpression of Akt/PKB Modulates N-myristoyltransferase Activity in Cancer Cells. J Pathol (2009) 218(3):391–8. doi: 10.1002/path.2550

[2] Zhu G , Wang F , Li H , et al. N-Myristoylation by NMT1 Is POTEE-Dependent to Stimulate Liver Tumorigenesis via Differentially Regulating Ubiquitination of Targets[J]. Frontiers in Oncology, 2021, 11:681366.

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云起 撰文

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