Moxi Go II库尔特流式细胞仪精准的细胞粒径测量助力新型基因编码钙指示剂研究

来自Janssen研发有限责任公司的Nyantsz Wu等人，对荧光基因编码钙指示剂GCaMP6s与合成钙指示剂fluo-4进行了性能比较，相关研究以“High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator”为题，发表在《Scientific Reports》上。在文章中，作者构建了一个稳定表达GCaMP6s的克隆细胞系，并通过流式细胞分析仪(flow cytometry)和荧光成像(FLIPR)等技术，对GCaMP6s与合成钙指示剂fluo-4在各种检测模式下的性能进行比较。

在本次实验中，作者采用美国Orflo Technologies公司的Moxi GO II 库尔特流式细胞仪进行流式细胞实验，通过488nm激发激光和525/45nm发射滤光片，配合PMT检测荧光强度，采用Coulter法（库尔特法）测定细胞大小，直径小于9微米的细胞被认为是细胞碎片，排除在计数数据之外。

首先，采用流式细胞实验对GCaMP6s与fluo-4的荧光光谱进行分析，比较fluo-4标记293-F细胞与用pGP-CMV-GCaMP6s转染 24小时的细胞的荧光强度（图1. a-c）

图1. 用GCaMP6s和fluo-4标记293-F细胞的初步比较 (a - c)流式细胞实验对数变换荧光强度直方图. (a)未标记细胞，(b)瞬时表达pGP-CMV-GCaMP6s，(c)标记fluo-4的细胞（用缓冲液(红色)或10µM钙离子通道载体(蓝色)处理细胞）

然后，基于共聚焦显微镜和流式细胞仪，对GCaMP6s与fluo-4分别处理的细胞内钙离子变化进行可视化分析（图2）。

图2. 用GCaMP6s(a-c)和fluo -4(d-f)分别标记的稳定表达GluA 1o -γ4 293-F细胞共聚焦图像和流式细胞术检测结果(c,f)悬浮细胞流式细胞术荧光强度直方图：CP-465022(红色)，谷氨酸+ LY-395153(橙色)，钙离子通道载体(蓝色)

最后，对流式细胞实验结果进行总结（表）。在每次实验中，测量所有直径大于9µm细胞的计数平均值(运行1,800-11,000个细胞)。数据以每次结果的平均值±标准差表示，实验次数用括号表示。细胞处理为CP-465022 (FCP);谷氨酸+LY-395153 (FPAM);钙离子通道载体 (Fiono)。ΔF为(FPAM -FCP)或(Fiono -FCP)。

通过流式细胞实验可以直接比较两种荧光指示剂的荧光强度。FLIPR（高通量实时荧光检测）实验测量大约10,000至20,000个细胞的总荧光强度，可以通过流式细胞仪测量大约10,000个细胞的算术平均值来模拟。研究人员发现，GCaMP6s标记的细胞在总荧光输出上比fluo-4标记的细胞低，但足以在FLIPR实验中提供稳健的反应。

作为一种新型的荧光基因编码的钙指示剂，GCaMP6s具有高亲和力、高表达量，不需要额外的染料加载，降低试剂成本，在细胞内Ca2+浓度变化的监测上显示出与fluo-4相当的动态范围和响应特性。此外，GCaMP6s还可以通过标准的分子生物学技术进行改造，以适应特定的实验需求。文章认为GCaMP6s是一个有前景的新型工具，作为合成钙指示剂的替代品，可以用于各种细胞生物学和药理学研究，尤其是在需要高通量筛选的现代药物发现领域。

在这项研究中，Moxi GO II 库尔特流式细胞分析仪作为一个实验工具，即开即用，操作简便，对于实现快速、准确的细胞内钙离子水平检测至关重要，对评估GCaMP6s这一遗传编码钙指示剂的性能和应用潜力具有重要意义。