项目文章 | Hortic Res海南大学运用蛋白组学+转录组学探究油茶种子成熟动态图谱

2021-08-16 12:58:37, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

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● 前言

2021年7月，海南大学园艺园林学院吴友根教授课题组等在《Horticulture Research》期刊发表了题为“Integrative iTRAQ-based proteomic and transcriptomic analysis reveals the accumulation patterns of key metabolites associated with oilquality during seed ripening of Camellia oleifera”的研究成果，通过RNA测序(RNA-seq)和iTRAQ标记定量蛋白组学技术研究方法，发现了油茶种子成熟过程中与油质相关关键代谢产物的积累模式特征，探究了不同成熟度油茶转录组和蛋白质组谱机理，描绘了海南油茶种子成熟过程的动态变化图谱。为该树种的遗传改良提供了理论依据。

中文标题：基于iTRAQ蛋白质组学和转录组学联合分析揭示油茶种子成熟过程中油质相关的关键代谢产物的积累

研究对象：油茶种子

发表期刊：Horticulture Research

影响因子：6.793

发表时间：2021.07.01

发表单位：海南大学园艺园林学院

运用生物技术：RNA测序(RNA-seq)和iTRAQ标记定量蛋白组学、转录组学、蛋白组学

文章中iTRAQ标记定量蛋白组学由欧易/鹿明生物提供技术支持

● 研究背景

油茶(Camellia oleifera, C. oleifera)原产于东亚山茶属的一种油料作物的山茶科。作为一种重要的经济树种，具有较高的生态、经济和药用价值。

油茶的种子在成熟过程中会经历一系列复杂的生理生化变化，主要表现为某些与油质密切相关的代谢产物，特别是黄酮类和脂肪酸的积累和转化。本文为了探究其潜在的分子机制，作者运用RNA测序（RNA-seq）和iTRAQ标记定量蛋白组学，对不同成熟度水平的油脂种子进行了研究。不仅揭示了关键候选基因和蛋白质的时间特异性表达，而且为该树种的遗传改良提供了科学依据。

●研究技术

图 | 油茶种子中与类黄酮合成相关的生化途径图中蛋白质和转录组的表达

● 研究结果

1.油茶发育过程中生理特性的变化

作者共采集了四个发育期：营养合成期（S1）、脂肪积累期（S2）、成熟期（S3）和晚熟期（S4）。测定种子发育的四个时期的表型特征和贮藏积累动态变化(图1)并测定了油茶样本中主要成分的组成和含量。

图1 | 油茶种子发育

油茶花种子四个生长期的表型特征。S1，营养合成阶段;S2，脂肪积累期;S3,成熟阶段;S4为成熟期晚期。B发育果实和种子形态指标的变化。数据代表三个生物重复的平均值，误差棒表示标准差。

2.转录组学分析

作者通过RNA测序(RNA-seq)对四个生长期样品的两两比较，共鉴定出16,530个DEGs。在3对发育阶段中，生物过程类中与代谢过程和氧化还原过程相关的DEGs较多；催化活性是分子功能范畴的主要分类；在细胞成分类别中，分配最多的分类是细胞壁。这些DEGs的KEGG富集分析可能为了解油茶种子主要代谢过程的分子机制提供信息。在所有的比较分析中，大多数的通路包括谷胱甘肽代谢、苯丙素生物合成和类黄酮生物合成。其他重要途径包括脂肪酸降解、脂肪酸生物合成、α-亚麻酸代谢，亚油酸代谢。

图2 | 鉴定的DEGs在茶油种子发育过程中的表达分析与定量比较

A.韦恩图；

B.不同比较中上调和下调的单基因数量；

C.四个生长期的DEGs的层次聚类分析。横轴表示样本簇，从绿色到红色表示基因表达由低到高；

D：鉴定出的DEGs表达趋势。基因丰度表示为对数倍变化(y轴)，发育阶段在x轴上，S1期为零点。

类黄酮和脂肪酸合成代谢相关基因的鉴定及相互作用网络分析，作者获得了115个参与苯丙类生物合成途径的DEGs。在类黄酮生物合成途径、黄酮及黄酮醇生物合成途径和异黄酮生物合成途径中分别检测到37、9和4个DEGs，可能与类黄酮的合成调控有关。同时，作者发现了39、14和53个候选deg分别与脂肪酸生物合成、脂肪酸延伸和脂肪酸降解途径相关。在亚油酸代谢途径和α亚麻酸代谢途径中分别鉴定出26和58个DEGs。

随后，构建了一个蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络来预测所识别的DEGs的假定功能和关系。综合分析表明，在与类黄酮生物合成相关的137个基因编码基因中，有56个基因编码基因(19个独特的蛋白)被紧密连接。同样，在参与脂肪酸代谢的137个DEGs中，109个DEGs(30个独特的蛋白)表现出强烈的相互作用。

图3 | 使用综合生物标志物分析的几个典型代表性样本预测示意图

基因共表达网络分析，为了识别油茶种子成熟过程中油脂品质相关的WGCNA模块，作者将总黄酮、油脂和主要脂肪酸的显著变化与高通量RNA-seq数据集相结合，构建了一个共表达网络。共有92个不同的模块组成，以集群系统树图的形式呈现。值得注意的是，含有4350个unigenes的2个独特模块与总黄酮、油脂和脂肪酸的积累模式高度相关，其绝对相关系数大于0.8 (p值≤0.01)。然后，作者绘制了所有样本的基因的热图和条形图，以专门检测这些模块的转录表达谱，随后进行了富集分析，以探索转录组在上述模块中的生物学功能。最后，作者利用Cytohubba的12种算法筛选出更多关键的枢纽基因;

图4 | 油茶种子WGCNA模块的富集分析及基因网络

3.iTRAQ标记定量蛋白组学分析

作者运用iTRAQ标记定量蛋白组学对种子发育过程中蛋白质表达的定量比较，同时进行GO和KEGG通路富集分析。结果表明所有鉴定的蛋白被分为29类，主要涉及翻译和碳水化合物代谢。并且作者绘制了p值小于0.01的前20条KEGG通路的气泡图。在三对比较中，普遍富集的途径包括脂肪酸降解、苯丙素生物合成和脂肪酸代谢。其中，参与α-亚麻酸代谢的DAPs在S3 vs. S1组和S4 vs. S1组中都非常活跃。

图5 | 基于go的油茶种子发育过程中DAPs的功能分类及蛋白-蛋白相互作用

对类黄酮和脂肪酸合成代谢相关DAPs的鉴定及相互作用网络分析中，蛋白家族的13个成员可以调控类黄酮的合成，与脂肪酸生物合成相关的DAPs有18个对类黄酮和脂肪酸合成。在脂肪酸降解过程中，共检测到14个由烯酰辅酶A水合酶(MFP2s)、ADHs和10个其他成分组成的DAPs。作者通过iTRAQ蛋白组学的数据分析对类黄酮和脂肪酸合成代谢的关系网络提供了一些初步的见解。

蛋白质共表达网络分析：通过WGCNA分析，基于2682个个体蛋白的共表达模式构建了8个不同的模块，以各成熟期总黄酮、油脂和主要脂肪酸含量为表型数据，进行模块-性状相关性分析。在这些共表达蛋白网络中，由2250个基因组成的4个特定模块与类黄酮、油脂和脂肪酸具有较强的相关性。作者进一步检测了氧化还原过程和代谢过程中主要富集。同时发现被定位到51个KEGG通路，包括碳代谢、氨基酸生物合成、糖酵解/糖异生和脂肪酸代谢。最终在在S4期，黄酮类化合物、油脂和脂肪酸的积累可能受到调节。

与黄酮类和油脂合成代谢相关的DAPs的鉴定和功能分析，油茶种子中总黄酮和油脂含量与177种蛋白质丰度呈显著相关(p值< 0.05)。丰富了氧化还原过程和细胞芳香化合物代谢过程。KEGG分析表明，该蛋白可定位到74条通路，其中11条富集显著，主要涉及碳代谢和氨基酸的生物合成。此外，本研究共鉴定出65个独特的蛋白，最后，这些蛋白质种类出现在6个主要组。

4.转录组和蛋白质组数据的联合分析

为了评估转录组和蛋白质组之间的一致性，以及了解转录后的mRNA在蛋白质水平上是如何表现的，作者进行了RNA-seq和iTRAQ分析的联合分析。证明DEGs和DAPs参与类黄酮的生物合成和脂肪酸代谢。

图6 | 共表达的DEGs和DAPs的富集分析和层次聚类热图

● 研究结论

近年来，油茶育种目标逐渐由高产向优质转变;然而，目前有关其脂肪酸或其他活性成分的积累调控的研究仅基于转录组测序，无法提供完整的生物代谢图谱。作为转录组学的补充分析，蛋白质组学主要描述蛋白质表达谱，以描述生命系统中的功能方面。为此，采用RNA-seq、iTRAQ、GC-MS等技术初步分析了海南岛油茶种子成熟过程中营养成分的动态变化及其可能的分子机制。本研究共鉴定出16530个DEGs和1228个DAPs，丰富了目前对油茶转录组和蛋白质组的认识。在S3与S1的比较中，发现了最多的DEGs，而在S4与S1的比较中发现了最丰富的DAPs，这意味着生物过程在成熟阶段可能出现更大的变化。尽管转录组学结果覆盖了98%以上的差异表达蛋白，但DEGs和DAPs的表达水平一致性较差，这反映在Spearman相关系数较低。这一结果与有关土豆和辣椒的研究结果相似。

● 研究结论

综上所述，本研究应用RNA-seq转录组分析结合iTRAQ蛋白质组学技术，探讨油茶种子不同成熟期储量积累的动态变化。此外，作者还探讨了黄酮类化合物和脂肪酸的生物合成和代谢可能的调控机制。许多功能转录本(16530)和蛋白质物种(1228)的模式发生了显著变化，其中317个DAPs被转录组结果覆盖。结合结构基因(蛋白)或转录因子的表达谱及相应化合物的含量，对重要代谢产物的调控网络进行了探讨。结果表明，黄酮类化合物的合成能力在种子成熟过程中逐渐减弱，而脂肪酸的合成能力则先升高后下降。

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运用RNA-seq转录组分析结合iTRAQ蛋白质组学技术全面了解海南油茶品质相关基因和蛋白的作用提供了一个视角。此外，筛选相关途径中发生显著变异的候选基因或蛋白，可为其他油压植物的标记育种奠定基础。

文末看点｜lumingbio

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