项目文章 | 上海交通大学张荻研究员基于TMT定量蛋白质组学揭示莲花胚胎脱水保护生理网络调控

2022-03-25 04:18:51, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

前言

2021年12月，上海交通大学张荻课题组在Frontiers in Plant Science发表题为 TMT-Based Quantitative Proteomic Analysis Reveals the Physiological Regulatory Networks of Embryo Dehydration Protection in Lotus(Nelumbo nucifera)的研究成果，通过TMT标记蛋白质组学和平行反应监测蛋白靶向验证(PRM)技术研究方法，构建了莲花胚胎脱水保护的生理调控网络。为揭示荷花种子长寿的脱水保护机制提供了新的见解。

基本信息

中文标题：基于TMT定量蛋白质组学分析揭示了莲花胚胎脱水保护的生理调控网络

研究对象：莲花

发表期刊：Frontiers in Plant Science

影响因子：5.753

发表时间：2021.12

合作单位：上海交通大学

运用生物技术：TMT标记定量蛋白质组学、PRM蛋白靶向验证由鹿明生物提供技术支持

研究背景

莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)是一种古老的水生植物，属于莲科，含两个种，N. nucifera和N. lutea，分别被命名为中国莲和美国莲。莲是中国十大名花之一，它在中国作为食用和药用植物栽培已有7000多年的历史。莲的种子是黑色的、硬的、卵圆形，在它未成熟阶段，种子含水量较高，外部被绿色果皮所包被，内部具有发育的种胚。当种子达到成熟时，外壳坚硬并转变为暗褐色，种胚大量失水。莲子具有长寿和极耐储存的特点，被誉为"千年古莲"。二十世纪初，在中国辽宁省的泥炭层中挖掘出一些古莲子，它们仍能正常发芽和生长。根据14C同位素检测，这些种子的寿命超过1300年，是寿命最长的种子之一。莲作为水生植物，营养器官和种胚对脱水过程的反应存在巨大差异与其胚胎发育中特殊的保护机制有关。

研究思路

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研究方法

1. 样本策略：

莲花(N. nucifera "TaiKong 36")种子于2018年夏季在上海交通大学的自然条件下的栽培基地中获得。每天早上对荷花植物进行人工授粉，并记录时间。在授粉后15、18、21、24、27、30、40和50天收集不同发育阶段中的种子。去除种皮和子叶组织，收集0.2克的荷花胚胎并储存在离心管中，立即冷冻在液氮中，并储存在-80℃。

2. 常规检测：

生理学测量、相对含水量(RWC)——对不同发育阶段的胚胎进行加权计算鲜重(FW)，然后在70℃下干燥以获得恒重(DW)、抽提荷花胚胎中的总蛋白，并进行BCA法定量。

3. 组学研究：

TMT标记定量蛋白质组学分析、PRM靶向蛋白验证

研究结果

发育和脱水莲子胚胎的特征

莲子的整个发育和成熟过程大约需要40天，在此期间，种胚和果皮的形态和颜色发生明显改变（图1A）。在第一阶段，种胚主要进行胚胎发育。胚胎在18-21天达到形态成熟，种胚和果皮呈现鲜绿色，种胚的鲜重达到最大值，干物质在此阶段迅速积累（图1）。第二阶段，莲子在授粉后21-50天进入脱水成熟阶段，种胚和果皮形态上逐渐萎缩，颜色逐渐变加深（图1A）。

图1 莲子胚胎的发育和脱水特征。

(A)发育中的莲子的形态特征；(B)发育中的莲子胚的鲜/干重和相对水含量；(C)发育中的莲子胚的可溶性蛋白和糖含量。小写字母表示该指标在不同发育阶段有显著差异；P < 0.05。

TMT标记定量蛋白质组学和DEP筛选

采用TMT标记定量蛋白质组学技术对三个脱水特殊阶段（21、27和40DAP）的新鲜莲种胎进行了蛋白质组学分析，共鉴定了5,477个蛋白质。对测试样本进行了PCA分析，结果显示，不同组间样品具有很好的区分，每组的三个重复样本被聚集在一起。PCA的前两个成分占总方差的70％以上（图2A）。三个试验组之间共有815个差异表达蛋白。其中，198个（32%）和198个（26%）蛋白质丰度增加，而420个（68%）和558个（74%）蛋白质丰度在27DAP和40DAP组分别下降（图2B）。只有30个蛋白质的丰度在27DAP和40DAP组之间具有显著变化（图2C）。

图2 蛋白组整体差异情况

DEGs的生物信息学分析

在种胚脱水成熟期，从莲种胚中鉴定获得的815个DEPs采用了层次聚类和蛋白质功能分类分析（图3）。所有的DEPs被分为5个主要的表达谱系。聚类A（包含16个蛋白）和聚类B（566个蛋白）包含持续下调的DEP，聚类C（39个蛋白）和聚类E（185个蛋白）在种胚脱水过程中逐渐上调。聚类D仅包含4个在快速脱水阶段（27DAP）特异性上调表达的蛋白，包括脱水素蛋白RAB18（A0A1U7ZRR9）、二半乳糖二酰甘油合成酶（A0A1U7ZHL0）、蛋白质TORNADO（A0A1U7ZLU9）和一个未知功能蛋白（A0A1U8B9X3）。

图3 差异蛋白表达谱系

蛋白质相互作用网络分析

蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析是基于不同种子脱水阶段的DEPs而进行的，即618个来自快速脱水阶段(27/21 DAP)的DEPs和30个来自脱水末期阶段(40/27 DAP)的DEPs。在快速脱水阶段，上调的DEPs相互作用，参与"半乳糖代谢"、"糖酵解/糖异"、"内质网的蛋白质加工"、"淀粉和蔗糖代谢"。

脱水素蛋白Rab18-like(A0A1U7ZR9)、STAR-1Family DOT2(A0A1U8A3P7)和digalactosyldiacylglycerolsynthase(A0A1U7ZHL0)，在这个网络中的蛋白丰度的折叠变化最高（图4）。

图4 PPI网络图

PRM蛋白靶向验证

为了验证TMT蛋白组学数据，作者选择了18个与莲种胚脱水保护功能密切相关的候选DEPs进行PRM蛋白靶向验证。PRM鉴定了18个候选DEPs。这些蛋白质的表达模式在PRM和TMT的定量结果之间显示出类似的趋势。然而，PRM检测到的蛋白丰度的倍数变化值要大于TMT数据。这一结果在很大程度上支持了TMT数据的可靠性。

应激生理指标的验证

基于TMT标记定量蛋白质组学的生物信息学分析，对胁迫生理指标进行了测定，以验证莲种胚脱水的保护机制。在快速脱水阶段，REC和MDA含量的变化与RWC相反，它们的水平迅速增加（图6A，B）。ABA含量在快速脱水和脱水成熟阶段前略有增加（图6C）。上述指标的变化趋势表明，ABA作为上游信号参与了脱水诱导过程，在快速脱水阶段，莲种胚发生了严重的膜脂过氧化和质膜损伤。在18-27DAP期间，O²^-和OH^-抑制活性明显降低，H₂O₂水平增加了7倍（图6D-F），这表明在莲种胚脱水过程中产生了过多的ROS组分。

图6 应激生理指标的验证

研究讨论

本研究采用TMT标记定量蛋白质组学方法，揭示了荷花胚胎连续脱水和成熟过程中不同的蛋白质谱系。生物信息学分析表明，环境刺激、应激反应和蛋白质加工相关的生物过程非常活跃，碳水化合物代谢、ER中的蛋白质加工、DNA修复和抗氧化事件对荷花胚胎脱水有积极反应。此外，H₂O₂是诱发氧化应激损伤的主要ROS组分，GSH和VE作为主要的抗氧化剂，维持了荷花胚胎的REDOX平衡。ABA信号和低聚糖、LEA和HSP的积累可能是保证荷花种胚持续脱水和耐储藏性的关键因素。今后的研究重点是确定LEA、HSP和寡糖合成相关的关键蛋白的生物学意义，这对利用分子辅助育种或基因工程技术提高植物对脱水的耐受性具有很大价值。

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本研究采用串联质量标签（TMT）标记的蛋白质组学和平行反应监测（PRM）技术，对莲子脱水过程中的生理调控网络进行了深入研究表明，碳水化合物代谢（包括糖酵解/糖异成、半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、磷酸戊糖途径和细胞壁组织）、ER中的蛋白质加工、DNA修复和抗氧化事件对莲种胎脱水有积极的反应。在莲种胚脱水过程中，非酶促抗氧化剂和戊糖磷酸酶途径在抗氧化保护中起着主要作用。应激生理学检测表明，H2O2是诱发氧化应激损伤的主要活性氧（ROS）成分，谷胱甘肽和维生素E作为主要的抗氧化剂，在脱水过程中维持荷花胚胎的REDOX平衡。这些结果为揭示荷花胚胎脱水保护机制的生理学调控网络提供了新的见解。

文末看点｜lumingbio

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