项目文章 | 转录组学+蛋白组学为改善肝葡萄糖脂代谢机制提供了新见解

2022年1月，欧易/鹿明生物合作客户北京中医药大学教育部中医养生学重点实验室刘铜华教授课题组在Frontiers in Nutrition期刊发表了题为 “Mechanisms for Improving Hepatic Glucolipid Metabolism by Cinnamic Acid and Cinnamic Aldehyde: An Insight Provided by Multi-Omics ”的研究成果，通过转录组学和蛋白质组学研究方法，发现了肉桂酸（AC）和肉桂醛（AL）在改善葡萄糖脂代谢中的特征，探究了其代谢作用机理。为预防和治疗代谢紊乱等疾病提供了理论依据。

近年来，由于葡萄糖、脂质和能量代谢的破坏而导致的糖尿病等代谢性疾病患者数量的上升加剧了医疗保健系统的经济压力，这对公共卫生构成了重大威胁。因此，寻找预防和治疗葡萄糖脂代谢紊乱的新策略成为一个重要的研究课题。葡萄糖脂代谢的发生可归因于许多病原体。胰岛素抵抗、炎症、线粒体功能障碍、自噬破坏以及肠道微生物群重建都可能导致代谢紊乱。而肝脏作为一种重要的代谢器官，在调节碳水化合物和脂质代谢中起着核心作用。

目前，改善饮食被认为是最安全有效的治疗和预防代谢性疾病的方法，其中肉桂（主要是肉桂属植物八角肉桂和桂皮）及其成分被证明具有多种治疗作用，包括抗糖尿病、减轻体重、低脂血症和增强胰岛素敏感性。因此，使用膳食补充剂和来自肉桂的化学物质来控制血糖和血脂可能成为治疗代谢类疾病的新方法。

1.实验分组

(1) 肉桂酸组:按照体重20 mg/kg的量每天使用AC 

(2) 肉桂醛组:按照体重20 mg/kg的量每天使用AL

(3) 对照组:每天正常喂食

(4) 正常组:每天正常喂食

2.胰岛素耐量实验

治疗4周后进行ITT实验

3.生化测量

ITT实验后3天处死小鼠，收集血清标本。检测血糖、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血清中葡萄糖、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、测定游离脂肪酸(FFA)和血尿素氮(BUN)。

比色法测定ATP，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清素含量

4.形态学评估

组织切片，苏木精-伊红染色

5.转录组测序：RNA提取、文库构建、测序及差异表达基因分析

6.实时定量PCR

7.DIA蛋白质组学、PRM蛋白靶向验证

1. AC和AL对小鼠葡萄糖脂代谢的影响

对照组中的Db / db小鼠血糖水平和体重与正常组相比明显更高（图1C，D），为严重葡萄糖脂代谢受损。与之相比，利用AC和AL治疗4周后的 db / db小鼠的高血糖和肥胖得到明显改善。这说明两种化学物质都显著抑制了db / db小鼠体重的增加（图1D，E）。治疗四周后进行的ITT实验评估了db / db小鼠的基线血糖水平，并发现经过治疗后的db / db小鼠对皮下注射的胰岛素更敏感（图1F，G）。同时，AC处理显著减少了db/db小鼠的肝脏重量，降低了肝脏指数。AL处理虽然也有改善但不显著（图1H，I）。治疗组的AST，ALT和BUN水平显著降低，表明口服AC或AL可以改善db / db小鼠的肾功能和肝功能异常（图1P-R）。

图1 | AC和AL对小鼠葡萄糖脂代谢的影响

2. 组织学观察

对照组小鼠的HE染色显示肝脏中发生了严重的肝脏脂肪变性。AC和AL减少了脂质积累并部分恢复了破坏的肝索结构（图2A）。定量分析显示，治疗组的脂肪变性等级明显低于对照组（图2D）。与观察到的附睾脂肪重量变化一致，附睾脂肪组织的组织学观察表明，与正常组相比，db / db小鼠的脂肪细胞显著扩张，AC和AL减小了扩张的脂肪细胞的大小（图2B，E）。肝脏的染色表明治疗后肝糖原含量增加（图2C）。

图2 | 组织学观察。

（A）从小鼠收获的肝脏组织的HE染色。

（B）小鼠附睾脂肪（左侧）的HE染色。

（C）小鼠肝脏的染色。所有图像均在200×放大倍率下录制。

（D）脂肪变性等级分数的肝脏HE染色。

（E）从附睾脂肪HE染色中测量的脂肪细胞大小。

3. 转录组和蛋白质组研究

采用RNA-Seq转录组学分析和DIA蛋白质组学分析，研究了AC和AL对db/db小鼠的影响。转录组分析共鉴定出16812种不同的蛋白质编码转录本。其中，2837个（约16.9%）在正常组和对照组之间有显著差异，表明db / db小鼠在转录水平上与野生型小鼠显著不同。与对照组相比，共有3749个基因因摄入AC而发生显著改变（2201个下调，1548个上调），560个基因（430个下调，130个上调）因摄入AL而发生显著改变（图3B）。

DIA蛋白质组学分析鉴定出2729种蛋白质。正常组和对照组之间共发现1059个（约占总鉴定蛋白质的38.8%）DEPs，AC处理有230个蛋白质发生显著变化（109个上调，121个下调），AL处理有211个蛋白质发生显著变化（116个上调，95个下调）（图3C）。

图3 | 小鼠肝脏的转录组和蛋白质组以及差异表达基因（DEGs）和差异表达蛋白（DEPs）的功能富集分析。

4. DEG 和 DEP 的功能注释和扩充分析

通过GO富集分析发现，对照组db / db小鼠与正常组wt / wt小鼠之间的葡萄糖脂和能量代谢途径存在显著差异。双饼环图显示，AC和AL显著改变了代谢途径中的基因和蛋白质表达。两种处理在分子机制上显示出相似的模式，并且大一部分DEGs和DEPs与代谢过程有关（图3D）。DEPs中GO的富集表明，AC和AL特别调控脂质代谢，包括脂肪酸代谢、长链脂肪酸和胆固醇的运输以及HDL颗粒清除（图3E）。值得注意的是，大量DEPs富集在线粒体等细胞器中，这些细胞器是多种代谢途径和维持能量平衡所必需的。

5. AC和AL对参与葡萄糖脂代谢的关键因素的影响

蛋白质组数据分析鉴定出了几种参与肝葡萄糖脂代谢的蛋白质（ACC、FASN、SCD1、CPT1A、GLUT2、GK、GS、G6Pase、PEPCK）。此外，AC显示出抑制脂肪生成酶（ACC，FASN和SCD1）表达的趋势，同时显著上调了GLUT2。与对照组相比，AC显著增加了PEPCK的表达，两种化学物质对G6Pase均无显著影响（图4A）。PRM蛋白靶向验证测定结果与蛋白质组变化相一致，这进一步证实了蛋白质组学数据中蛋白质的表达（图4B）。

图4 | AC和AL对参与葡萄糖脂代谢的关键因素的影响。

6. AC和AL改善了db/db小鼠的线粒体功能

转录组学和蛋白质组学联合分析结果显示AC和AL显著改善了线粒体功能。GSEA分析显示，处理组的氧化磷酸化（OXPHOS）通路显著上调，AC组和AL组的富集得分分别为0.826和0.535（图5A）。热图显示，AC或AL处理后，OXPHOS中涉及的复合物的许多基因和蛋白都上调了（图5B）。通过PRM蛋白靶向验证检测了其中一些蛋白的表达，结果表明除了NDUFS4之外，大多数结果与蛋白质组一致（图5C）。

根据这一证据，作者认为AC和AL治疗可以通过增强OXPHOS功效来改善线粒体功能（图5D）。但是，处理组的ATP含量显著低于对照组（图5E）。OXPHOS过程产生ATP以便为生命活动提供能量。作者假设这是因为在AC和AL组中，ATPases被上调（图6A，B），消耗了产生的ATP。

图5 | AC和AL改善了db / db小鼠的线粒体功能。

7. AC和AL对色氨酸代谢的影响

生物信息学分析表明，色氨酸代谢途径中DEGs和DEPs显著富集，AC和AL显著提高了色氨酸代谢的基因和蛋白表达。AC和AL都显著上调IDO2，MAOB，ALDH7A1，并且AL也显著诱导IDO1和KYAT1（图6C，D）。大部分色氨酸被代谢为犬嘌呤，最终形成NAD+（48），参与能量代谢。通过对小鼠肝脏中血清素含量的ELISA测定，AC和AL都显著降低了db / db小鼠中血清素含量（图6E）。结合以上证据，说明这两种化学物质可以调节色氨酸的代谢，特别是增加肝脏中血清素的降解（图6F）。

图6 | AC和AL对db / db小鼠肝脏色氨酸代谢的影响。

8. AC和AL对自噬介导脂清除的影响

自噬过程使细胞能够循环利用必要的细胞成分和适应应激条件。肥胖和糖尿病患者的自噬进程会下降。文中组学结果表明，AC和AL可能会影响小鼠肝细胞的自噬。大量的DEG在吞噬体，内吞作用和溶酶体中富集。在蛋白质组学中，AC显著上调了脂质代谢有关基因（LDLR，SRB1，SEC61A1和MRC1）。AL显着增加了LDLR，LRP1，Cathepsin S（图7A，B）和vATPase（ATP6V1C1）、（图6A，B）的表达，它们与LDL清除率和吞噬体形成相关。之后作者进一步确认了脂蛋白的组成，结果与上述发现一致。在AC组和AL组中，APOA2和APOE的含量显著降低（图7A）。这些结果表明，自噬介导的肝脏脂质清除在治疗小鼠中恢复（图7C）。

图7 | AC和AL对自噬介导的脂质清除的影响

综上所述，AC和AL治疗4周后均能改善db/db小鼠的代谢紊乱状况。通过转录组学和蛋白质组学联合分析作者也确定了几种可能的治疗机制， AC和AL由于它们在体内的代谢特性而在分子机制上有很多共同点：（1）改善线粒体功能，特别是改善OXPHOS过程；（2）增加色氨酸代谢，降低血清素水平；（3）改善自噬，加速含TG和胆固醇的脂质清除。因此为后续研究AC和AL预防和治疗代谢性疾病开拓了新的思路。

参考文献

Fabbrini E, Sullivan S, Klein S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. (2010) 51:679–89. doi: 10.1002/hep.23280

肉桂作为一种天然产品，其内两种重要的化学物质（AC和AL）对抗糖尿病、减轻体重、低脂血症和增强胰岛素敏感性等方面具有一定的作用。文章作者通过转录组学和蛋白质组学联合技术对db/db小鼠肝组织进行了研究，分析了AC和AL对db / db小鼠葡萄糖脂代谢等方面的影响。研究结果表明，经AC和AL治疗4周后，db/db小鼠的代谢紊乱状况得到改善。本文研究体现了组学技术在机制研究中的重要作用。

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