项目文章 | 胡培松院士团队：首次利用基因编辑创制香味改良三系杂交稻

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2021年8月，中国水稻研究所胡培松院士团队在Plant Biotechnology Journal期刊发表了题为“Production of aromatic three-line hybrid rice using novel alleles of BADH2”的研究成果，依靠GC-MS顶空代谢组学的平台，研究新型BADH2等位基因生产芳香杂交水稻机理，加快了水稻品种香味研究改良进程。

香味是决定稻米烹饪和食用特性的独特和关键指标之一。甜菜碱醛脱氢2(OsBADH2)功能的丧失影响了2-乙酰-1-吡咯啉(2- ap)的生物合成，而2-乙酰-1-吡咯啉(2- ap)是香稻香气的主要来源。高品质香米的高需求和低供给直接导致了全球市场香米价格上涨。这也促使水稻育种家加快了开发新的高产香稻品种的速度，以满足消费者日益增长的香稻需求。传统育种或标记辅助育种技术用于芳香基因导入和芳香水稻基因型的选育往往费时费力，随着植物生物技术的进步，基因组编辑技术使现有香稻品种的改良和从非香稻品种中培育出香稻成为可能。

本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在粳稻宁粳1号(NJ1)和籼稻黄花展(HHZ)品种的遗传背景下，构建BADH2新等位基因。采用GC-MS顶空技术对BADH2等位基因系成熟籽粒进行性状分析。

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1. 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术-构建BADH2新等位基因

研究团队首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了携带水稻U6启动子和靶向BADH2基因第二外显子的单导RNA (sgRNA)的CRISPR/Cas9载体(图1b)。通过农杆菌介导将BADH2 CRISPR/Cas9结构插入粳稻宁粳1号(NJ1)和籼稻黄华占(HHZ)中，在NJ1、HHZ遗传背景下，利用pcr筛选和Sanger测序，在T0代鉴定出5种BADH2纯合新等位基因。为了获得BADH2的非转基因新等位基因，研究团队在T1群体中跟踪分离了含有所需BADH2基因突变的T-DNA (图1d)，并经Cas9和HPT的PCR结果验证均为阴性，证实T-DNA的缺失(图1e)。

图1 | BADH2新等位基因的鉴定及无t - dna植物的筛选

2.将BADH2等位基因系与野生型的农艺性状进行比较分析

研究团队通过对BADH2等位基因系和野生型植株的栽培分析其农艺性状，研究结果显示：

（1）nj1-crBADH2-1和nj1-crBADH2-2的粒长和千粒重显著增加；（2）nj1-crBADH2-1株系的粒宽显著增加，而nj1-crBADH2-2株系的粒宽没有变化(图2b和d)；

（3）nj1-crBADH2-1和nj1-crBADH2-2品系的每穗粒数和粒厚与野生型无显著差异(图2a和d)；

（4）HHZ - crbadh2 -1和HHZ - crbadh2 -2株系的HHZ、粒厚和千粒重显著降低(图2b-d)；2个株系的结实率和株高显著降低，有效分蘖数显著增加(图2a和d)。

图2 | BADH2种质新等位基因农艺性状分析

3.感官评价+ GC-MS顶空技术分析BADH2等位基因系水稻籽粒中的2-AP相对含量

研究团队结合感官评价、GC-MS顶空代谢组学技术，对成熟籽粒中香味物质及2-AP进行定量分析，结果表明，4个剔除转基因成分的T1纯合BADH2等位基因系 (nj1-crBADH2-1, nj1-crBADH2-2，hhz-crBADH2-1和hhz-crBADH2-2)的香气适中，2-AP含量显著增加。成熟籽粒挥发物质GC-MS顶空分析数据也证实，2-AP是BADH2等位基因系与对应野生型中差异最显著的挥发物质（图3、图4）

图3 | BADH2系新等位基因的芳香鉴定

图4 | HHZ背景种子中无目标挥发物的GC-MS顶空分析

4. BADH2等位基因系籽粒品质性状研究

研究团队通过对BADH2等位基因系与野生型品种籽粒品质性状的分析，发现直链淀粉含量(图5a)、凝胶稠度(图5b)、淀粉粘度(图5c)和淀粉糊化特性(图5d)均无显著变化。这些结果表明，OsBADH2的CRISPR/Cas9编辑产生了新的BADH2等位基因，在不影响其他品质性状的情况下，改善了籽粒香气。

图5 | BADH2新等位基因籽粒淀粉理化性质的测定

5.杂交获得芳香型三系杂交水稻，并利用GC-MS顶空技术分析籽粒中2-AP含量

在确认了hhz-cr BADH2-1和hhz-cr BADH2-2等位基因可以显著提高籽粒中2-AP含量后，研究团队将2个HHZ背景BADH2新等位基因系与香型三系不育系桃农1A (TN1A)进行杂交，获得了具有较高籽粒香气的三系杂交品种B-桃优香占(BTYXZ)。利用GC-MS顶空代谢组学技术测定表明，改良的BTYXZ-1和BTYXZ-2籽粒中2-AP含量显著增加。同时该研究团队也对BTYXZ进行了全面的稻米理化性质评估、米饭质地以及食味评价，结果表明BTYXZ的胶粘度相比原品种有所增加，米饭质地变软，但综合食味评分未发生显著变化。最后，该研究团队利用高效液相色谱（HPLC）技术对改良的BTYXZ与原品种TYXZ籽粒中γ-氨基丁酸（GABA）进行测定，并分析了GABA与2-AP的相关性，为富含GABA的优质香型功能稻米研发提供了数据支撑和理论参考。

图6 | BADH2新等位基因系与BTYXZ杂交种2-AP含量和农艺性状分析

图7 | 香味改良BTYXZ杂交种淀粉理化性质测定

图8 | 改良香型BTYXZ杂交种的质构和口感评价

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsBADH2进行定点诱变，可以成功地在水稻籽粒中创建新的BADH2等位基因，改善水稻的香气。在三系杂交稻增香育种中，新等位基因BADH2与TN1A杂交表现出良好的亲和性。此外，利用GC-MS顶空代谢组学技术在BADH2的新等位基因系和野生型的成熟种子中发现了几种不同的挥发性化合物。香气由多种复杂的挥发性化合物组成，了解它们的代谢途径是提高水稻香气产生的一个有趣的研究领域。

顶空GC-MS测定技术采用顶空气体进样器，原始样本可不经任何前处理步骤，直接装入进样小瓶，仪器会自动采集进样小瓶中挥发性物质，并对其成分进行检测分析，分析数据能够最大程度还原样本中的挥发性物质的相对含量以及种类。鹿明生物顶空GC-MS代谢组学测定技术还可用于茶叶、花卉以及各种农产品中酚类、酯类、醇类等挥发类代谢物使挥发性物质成分检测。

文献参考：

[1] Yang, T.; Li, H.; Tai, Y.; Dong, C.; Cheng, X.; Xia, E.; Chen, Z.; Li, F.; Wan, X.; Zhang, Z. Transcriptional regulation of amino acid metabolism in response to nitrogen deficiency and nitrogen forms in tea plant root (Camellia sinensis L.). Sci. Rep. 2020, 10, 6868.

[2] Lin, W.; Huang, T.; Chiou, T. Nitrogen limitation adaptation, a target of microRNA827, mediates degradation of plasma membranelocalized phosphate transporters to maintain phosphate homeostasis in Arabidopsis. Plant Cell 2013, 25, 4061−4074.

[3] Zhang, X.; Abrahan, C.; Colquhoun, T.; Liu, C. A proteolytic regulator controlling chalcone synthase stability and flavonoid biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell 2017, 29, 1157−1174.

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灵犀 撰文

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