项目文章 | 医学一区TOP期刊！上海九院又一佳作：头颈部鳞状细胞癌顺铂耐药机制研究

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2021年6月8日，上海交通大学医学院附属第九人民医院张建军、陈万涛（蒋英英博士后、郭海艳医师为共同第一作者）教授团队在Molecular Therapy期刊发表了题为“Long noncoding RNA lnc-POP1-1 upregulated by VN1R5 promotes cisplatin resistance in head and neck squamous cell carcinoma through interaction with MCM5”的研究成果。

该研究以人细胞、小鼠及肿瘤组织为研究对象，运用iTRAQ标记定量蛋白质组学、表达谱芯片、RNA pull-down/LC-MSMS等技术，发现了HNSCC细胞中顺铂耐药的关键靶点及信号通路，确定了顺铂耐药相关蛋白VN1R5及其下游靶标lnc-POP1-1。为阐明顺铂耐药性的分子机制，提高HNSCC疗法的疗效提供新的参考。

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是由口腔、鼻腔和喉部粘膜鳞状细胞发展而来的癌症，是全球第七大常见癌症，每年约有60万例新发病例。由于其高局部复发率、高转移率和不良预后，HNSCC严重影响人类健康和生活质量。尽管外科手术、放疗和化疗的技术进步改善了HNSCC的局部控制，但HNSCC患者的5年生存率仍保持在60%左右。目前，顺铂是HNSCC最广泛使用的化疗药物。然而，一些患者出现顺铂耐药性，导致癌症复发，这种获得性耐药性是HNSCC患者顺铂治疗失败的主要原因。因此，研究导致HNSCC顺铂耐药的关键调控因素，探索顺铂耐药的分子机制，对于开发有效的治疗方法，提高HNSCC疗法的临床疗效具有重要意义。

研究发现，非核转录因子受体与HNSCC病的发生和发展密切相关，缺乏蛋白质编码潜力的RNA转录产物LncRNAs被认为在顺铂耐药性中起调节作用，已发现lncRNAs如MPRL、UCA1、KCNQ1OT1、HOTAIR和HOXA11-AS的表达水平与HNSCC的顺铂反应有关。然而，仍然迫切需要确定关键的功能性非特异性单克隆抗体，并阐明其促进顺铂耐药性的分子机制，以进一步提高HNSCC疗法的疗效。

1.VN1R5促进HNSCC细胞获得顺铂耐药性

本研究使用了对顺铂敏感(HN4和HN30)或耐药(HN4/DDP和HN30/DDP)的HNSCC细胞系，顺铂耐药的HNSCC细胞的存活率高于用相同顺铂剂量处理的相应顺铂敏感细胞的存活率。iTRAQ标记定量蛋白组学分析了顺铂敏感和顺铂耐药癌细胞中异常表达的蛋白质，发现VN1R5在顺铂耐药细胞中高度表达；

通过qPCR和Western blotting分析（图1 a-c），证实了VN1R5在顺铂耐药细胞中的上调，此外，与TPF方案敏感组织相比，VN1R5在TPF方案耐药的HNSCC组织中高度表达。使用CRISPR/Cas9技术在HNSCC细胞中敲除VN1R5基因，导致顺铂的IC50值显著降低；相反，VN1R5过表达显著增加了顺铂的IC50值，并促进用顺铂处理的HN4和HN30细胞中的集落形成。

在动物实验中，在顺铂治疗下，KO-VN1R5组的肿瘤体积和重量明显低于对照组，VN1R5过表达组的肿瘤体积和重量明显高于对照组，H&E和Ki-67染色的结果进一步证实了肿瘤形成的变化。这些结果表明VN1R5促进了HNSCC细胞获得顺铂耐药性。

图1 | HNSCC细胞中VN1R5表达上调与顺铂耐药相关

2.lnc-POP1-1被VN1R5上调，促进HNSCC细胞获得顺铂耐药

为了探究VN1R5调控的下游靶标，对VN1R5高表达或过表达的HNSCC细胞进行基因微阵列分析，lncRNA lnc-POP1-1被确定为响应VN1R5的下游靶标，Lnc-POP1-1的表达与VN1R5在HNSCC细胞中的表达呈正相关，lnc-POP1-1在顺铂耐药的HN4/DDP和HN30/DDP细胞中的表达水平明显高于相应的顺铂敏感的HN4和HN30细胞。此外，与TPF方案敏感组织相比，lnc-POP1-1在TPF方案耐药的HNSCC组织中高度表达，Lnc-POP1-1的表达与VN1R5在HNSCC组织中的表达呈正相关。

通过细胞质/细胞核分级和荧光原位杂交(FISH)分析，发现Lnc-POP1-1主要分布在HNSCC细胞的细胞核中。lnc-POP1-1的沉默导致顺铂在HN4/DDP和HN30/DDP细胞中的IC50显著降低，并抑制用顺铂处理的HN4/DDP和HN30/DDP细胞中的集落形成。

在动物实验中，qPCR结果显示ASO-1在抑制HN30和HN30/DDP细胞lnc-POP1-1表达方面最有效，在顺铂治疗下，lnc-POP1-1敲除组的肿瘤体积和重量明显低于对照组；相反，lnc-POP1-1的过度表达增加了顺铂的IC50并促进用顺铂处理的HN4和HN30细胞中的集落形成。此外，lnc-POP1-1过表达组的肿瘤体积和重量明显高于用顺铂治疗的对照组。这些结果表明lnc-POP1-1是对VN1R5有反应的下游靶标，并促进HNSCC细胞获得顺铂耐药性。

图2 | lnc-POP1-1表达受VN1R5调控，并与VN1R5表达呈正相关

3.lnc-POP1-1介导VN1R5对HNSCC细胞顺铂耐药的促进作用

流式细胞术结果显示，HN4/DDP和HN30/DDP细胞的凋亡率明显低于HN4和HN30细胞，当VN1R5在HN4/DDP和HN30/DDP细胞中被敲除时，凋亡细胞的数量明显增加，与lnc-pop1-1-敲除实验的结果一致。在VN1R5过表达的HNSCC细胞中，当lnc-POP1-1被同时敲除时，凋亡细胞的数量显著增加，然而VN1R5 KO没有显著增加过度表达lnc-POP1-1的HNSCC细胞的凋亡率。

在动物实验中，在暴露于一定浓度顺铂的条件下，皮下注射稳定表达VN1R5的HN30细胞，小鼠的肿瘤体积和重量显著增加，通过敲除lnc-POP1-1而逆转。相反，在顺铂治疗下，lnc-POP1-1的过表达显著逆转了VN1R5 KO诱导的肿瘤生长减少。这些结果表明VN1R5以lnc-POP1-1依赖的方式影响HNSCC细胞的顺铂耐药性。

图3 |  lnc-POP1-1受VN1R5调控，影响HNSCC细胞对顺铂的耐药

4.VN1R5通过转录因子Sp1激活lnc-POP1-1的表达

为了进一步研究VN1R5调节lnc-POP1-1的机制，预测了占据lnc-POP1-1启动子区域的TFs。当预测的转录因子在HNSCC细胞中被单独敲除时，发现Sp1敲除下调了HN4/DDP和HN30/DDP细胞中lnc-POP1-1的表达。相反，Sp1过表达上调了HN4和HN30细胞中lnc-POP1-1的表达。此外，Sp1的敲除逆转了lnc-POP1-1在VN1R 5-过表达HN4和HN30细胞中的表达，而Sp1的过表达逆转了lnc-POP1-1在KO-VN1R5 HN4/DDP和HN30/DDP细胞中的表达。在VN1R5过表达或KO-VN1R5 HNSCC细胞中，磷酸化Sp1(p-Sp1)的表达水平与VN1R5的表达水平呈正相关。

为了验证Sp1与lnc-POP1-1启动子的结合，并进一步确定结合位点的基序，进行了染色质免疫沉淀(ChIP)和荧光素酶分析。ChIP分析结果表明Sp1富集在lnc-POP1-1启动子片段的碱基对-2000/-1801上；荧光素酶报告基因(包括Sp1结合位点D和E)在野生型Sp1表达下被显著激活，但沉默Sp1表达显著抑制HNSCC细胞中的荧光素酶报告基因活性。VN1R5激活调节HNSCC细胞Sp1活性的途径研究发现，多种信号通路，包括cAMP/PKA、PI3K和p38 MAPK通路，与多种癌症中Sp1的表达有关，因此，PKA抑制剂、PI3K抑制剂1和p38 MAPK抑制剂被用来表征VN1R5在介导Sp1磷酸化中的潜在作用。研究结果表明，VN1R5通过cAMP/PKA途径调节Sp1的转录活性以影响lnc-POP1-1的表达。

图4 | VN1R5通过调控Sp1的启动子活性来影响lnc-POP1-1的表达

5.lnc-POP1-1促进DNA修复过程并与MCM5结合

为了深入研究lnc-POP1-1影响HNSCC细胞顺铂耐药性的机制，研究者使用RNA pull-down和蛋白质谱分析(LC-MS/MS)来探索推定的与lnc-POP1-1相互作用的RNA结合蛋白。顺铂耐药的HN4/DDP和HN30/DDP细胞表现出比顺铂敏感的HN4和HN30细胞更低的γH2AX(一种DNA损伤标记物)表达。此外，HN4/DDP和HN30/DDP细胞显示出增强的DNA修复，换而言之，DNA修复途径在顺铂耐药的HN4/DDP和HN30/DDP细胞中是明显的。

GO分析还表明，重组蛋白在脱氧核糖核酸修复、脱氧核糖核酸复制、双链断裂(DSB)修复、细胞对脱氧核糖核酸损伤刺激的反应等方面起着重要作用。

用蛋白质-RNA相互作用预测因子预测了假定的RBPs和lnc-POP1-1之间可能的结合位点，在RNA pull-down之后进行Western blot分析，确认MCM5是与lnc-POP1-1的RBP结合，MCM5和lnc-POP1-1之间的相互作用。

通过RNA免疫沉淀(RIP)分析在HN4和HN30细胞中得到证实。lnc-POP1-1在MCM5上的一个可能结合位点位于氨基酸位置724的精氨酸(R)残基上，而碱基对600-609的核苷酸是lnc-POP1-1序列上假定的MCM5结合位点。基于用RIP引物获得的结果，推测lnc-POP1-1的碱基对600-609的核苷酸可能负责与MCM5的结合。通过构建缺失碱基对600-609 (lnc-POP1-1-Mut)的lnc-POP1-1突变质粒，研究预测结合位点对HN4/DDP和HN30/DDP细胞顺铂耐药性的影响。结果显示，用lnc-POP1-1突变质粒转染的HNSCC细胞的顺铂耐药性低于用WT质粒转染的HNSCC细胞。

图5 | lnc-POP1-1与MCM5结合，参与DNA修复途径

6.lnc-POP1-1通过减少MCM5的泛素化，阻止了MCM5通过蛋白酶体途径降解

实验表明，MCM5降解与蛋白酶体部分相关，lnc-POP1-1的过度表达导致MCM5蛋白的衰变速度减慢。当lnc-POP1-1被敲除时，MCM5水平在细胞核中降低；当lnc-POP1-1过表达时，MCM5水平在细胞核中增加，这表明lnc-POP1-1有助于MCM5在细胞核中的保留。MCM5在HN4/DDP和HN30/DDP细胞中免疫沉淀后，在lnc-POP1-1沉默的细胞中检测到明显高于对照细胞的MCM5蛋白泛素信号，MCM5泛素化在过度表达lnc-POP1-1的细胞中低于对照细胞。

图6 | lnc-POP1-1与MCM5结合抑制MCM5泛素化

7.lnc-POP1-1通过与MCM5相互作用影响HNSCC细胞对顺铂的耐药

MCM5在HN4和HN30细胞中的过度表达增加了顺铂的IC50。MCM5的下调导致顺铂在HN4/DDP和HN30/DDP细胞中的IC50显著降低。使用SS-lnc-POP1-1沉默lnc-POP1-1显著阻断MCM5在HN4和HN30细胞中促进顺铂抗性的能力。lnc-POP1-1的沉默也显著协调了MCM5敲除促进HNSCC细胞顺铂敏感性的能力。

在动物实验中，在暴露于一定浓度的顺铂的条件下，皮下注射稳定表达MCM5的HN30细胞的小鼠肿瘤体积和重量的显著增加，通过敲除lnc-POP1-1而逆转。相比之下，在顺铂治疗下，沉默lnc-POP1-1会加剧MCM5敲除介导的肿瘤体积和重量的显著减少。这些结果表明lnc-POP1-1通过与MCM5相互作用影响HNSCC细胞对顺铂的耐药性。

图7 |  lnc-POP1-1通过与MCM5相互作用影响HNSCC细胞对顺铂的耐药

本研究旨在寻找HNSCC细胞中顺铂耐药的关键信号通路。Vomeronasal type-1 receptor 5 (VN1R5) 被鉴定为顺铂耐药相关蛋白，在顺铂耐药的HNSCC细胞和组织中高度表达。长链非编码RNA (lncRNA) lnc-POP1-1被证实是VN1R5诱导的下游靶标。VN1R5通过环AMP(cAMP)/蛋白激酶A (PKA)通路激活特异性蛋白1 (Sp1)转录因子来转录调节lnc-POP1-1的表达。VN1R5以lnc-POP1-1依赖性方式促进HNSCC细胞中的顺铂耐药性。

从机制上讲，lnc-POP1-1直接与微染色体维持缺陷5 (MCM5)蛋白结合，并通过抑制MCM5蛋白的泛素化来减缓MCM5的降解，从而促进顺铂引起的DNA损伤的修复。总之，本研究确定了顺铂耐药相关蛋白VN1R5及其下游靶标lnc-POP1-1。在VN1R5上调后，lnc-POP1-1通过与MCM5相互作用并减缓其降解来促进HNSCC细胞中的DNA修复。

本文是一篇高水平的药物耐药机制研究的文章，通过临床研究、细胞实验、动物体内实验，结合基因沉默/过表达、WB、qPCR、iTRAQ蛋白组、表达谱芯片、RNA pull down/LC-MSMS蛋白鉴定等技术手段，发现并验证了关键调控靶点及信号通路与HNSCC细胞顺铂耐药性的相关性。目前，基因/转录组、蛋白组、代谢组等组学技术，往往可以帮助研究者从整体层面筛选、挖掘潜在目标靶点，由于组学数据都是包含有海量信息，多组学相结合的分析手段，将大大提高关键信息发现的效率与准确性，以及提升后续验证的成功率。本文为耐药机制深入研究提供了很好的参考。

参考文献：

Jiang Y, Guo H, Tong T, et al. Long noncoding RNA lnc-POP1-1 upregulated by VN1R5 promotes cisplatin resistance in head and neck squamous cell carcinoma through interaction with MCM5[J]. Molecular Therapy, 2021.

Qin X, Guo H, Wang X, et al. Exosomal miR-196a derived from cancer-associated fibroblasts confers cisplatin resistance in head and neck cancer through targeting CDKN1B and ING5[J]. Genome biology, 2019, 20(1): 1-21.

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Silence 撰文

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