项目文章 | TOP期刊！南京大学孙媛媛组仅使用GC-MS代谢组学就发表了IF=6.551文章

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欧易/鹿明生物客户南京大学地球科学与工程学院孙媛媛教授团队在Science of the Total Environment期刊发表了题为“Response of cucumber (Cucumis sativus) t o p e rfluorooctanoic acid in photosynthesis and metabolomics”的研究成果，该研究以土壤栽培的黄瓜(Cucumis sativus)为试验对象，运用GC-MS代谢组学研究了全氟辛酸（PFOA）对黄瓜的光合作用和抗氧化能力等的影响。并利用GC-MS对黄瓜组织进行代谢组学研究，揭示了全氟辛酸（PFOA）对植物毒性的机理，对于今后对农业土壤中全氟辛酸（PFOA）的风险评估提供了重要依据。

全氟辛酸（PFOA）是一种普遍存在的合成化学物质，其在工业、商业和人们的日常消费品中的广泛应用会引起严重的环境污染问题，最终威胁生态环境安全及人体健康。研究表明，PFOA在环境中长时间的停留可能会导致PFOA从土壤向作物的累积，转移并存储在各种植物器官中，从而影响作物生长。

目前对于PFOA的不利影响和风险的研究多集中在水生生态系统和动物实验上，对土壤中PFOA如何影响植物生长，以及植物如何应对PFOA胁迫的了解尚少。此外，研究发现PFOA积累可引起氧化应激，从而影响细胞代谢。但是，其潜在的毒性机制在很大程度上尚未明确，故需要对PFOA毒性的评估及其对陆地生态系统的潜在影响的能力进行深入探究。

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1.实验分组及前处理

从农田收集的土壤中施加0、0.2和5 mg/kg（土壤）的有放射性标记的PFOA-[1-¹⁴C] (¹⁴C-PFOA)，添加了PFOA的土壤置于盆中进行黄瓜栽培，PFOA处理24 h后播种黄瓜种子。共有3种处理方式，包括对照组（无PFOA），0.2 mg/kg 的PFOA处理组，以及5 mg/kg 的PFOA处理组，每个处理组都有4个生物学重复（样本策略）。播种前采集土壤样品进行了放射性分析，0.2和5 mg/kg处理的PFOA初始浓度分别为0.22和4.82 mg/kg。

2.检验方法

（1）生物量测定：发芽60天后收获植株，洗净并分离成根、茎、叶部分，冻干后测定黄瓜生物量。

（2）PFOA含量检测：通过测量放射性¹⁴C来评估土壤和植物中PFOA的浓度；

（3）光合指标分析：用分光光度法测定叶片中叶绿素含量。用Li-Cor 6800便携式光合系统测定叶片的净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度和蒸腾速率；

（4）代谢组学分析：GC-MS非靶向代谢组学

1.¹⁴C-PFOA的积累和黄瓜的生物量检测

¹⁴C-PFOA的积累：本研究采用¹⁴C放射性示踪剂跟踪植物组织对PFOA的吸收和转运。结果表明，即使在低浓度下，PFOA也会对土壤和植物产生影响（图1）。栽培土壤中添加PFOA的黄瓜的所有组织中都发现了¹⁴C标记的化学物质，叶片中含量最高，其次是根和茎。

图1 | 经 0 (control)、 0.2 和 5 mg/kg PFOA处理的土壤栽培60天黄瓜根、茎、叶中¹⁴C-化合物浓度

黄瓜的生物量检测：PFOA处理下黄瓜的平均生物量均低于对照组（图2），但0.2 mg/kg和5 mg/kg处理之间的生物量差异并不显著，说明影响黄瓜生长的因素除剂量效应外，还有其他因素。

图2 | 经 0 (control)、 0.2 和 5 mg/kg PFOA处理的土壤栽培60天后黄瓜根、茎、叶的干重

2.黄瓜对PFOA的光合响应

为了解叶片中全氟辛酸的积累对叶绿素含量和光合作用影响，进行了光合指标的分析。结果表明， 与对照相比，PFOA显著降低了光合色素（Chl a、Chl b和Caro）的含量（图3）。另外，通过气体交换分析，评价了光合作用对PFOA的响应。结果表明，经PFOA处理的叶片，其细胞间CO₂浓度（Ci；图4B）、蒸腾速率（Tr；图4C）或气孔导度（Gs；图4D）并无显著性差异。但是，在经0.2 和 5 mg/kg PFOA处理的黄瓜中发现净光合速率下降。与PFOA处理过的生物量变化相同，经0.2 mg/kg和5 mg/kg处理的叶绿素含量和净光合速率的差异并不显著。

图3 | 经 (control)、 0.2 和 5 mg/kg PFOA处理的土壤栽培60天后黄瓜叶片中叶绿素（Chl, mg/g鲜重）含量

作者推测，叶绿素含量降低和净光合速率降低可以解释经PFOA 处理的黄瓜生物量减少。在PFOA胁迫下，黄瓜植物可能会遭受活性氧（ROS） 信号级联反应，导致光合作用下降，从而使得生长受限。

图4 | 经 0 (control)、 0.2 和 5 mg/kg PFOA处理的土壤栽培60天后黄瓜叶片

3.黄瓜对全氟辛酸（PFOA）的代谢响应

作者认为，上述叶绿素及光合指标等的生理变化可能源于细胞内代谢变化。作者使用GC-MS非靶向代谢组学方法，总共鉴定出191种代谢物，基于质谱指纹和保留指数匹配对它们进行半定量。使用MetaboAnalyst通过主成分分析（PCA）进行了无监督的聚类分析。结果表明，低PFOA组（0.2 mg/kg）与对照组之间没有明显的分离。然而，高PFOA组（5 mg/kg）在第一主成分（PC1） 上与对照组明显分离，解释率为23.8%。此外，在PCA模型中，0.2 mg/kg和5 mg/kg PFOA之间没有明显的分离。通过有监督的分类模型，低剂量和高剂量PFOA组与对照组明显分离（图5B）。这表明暴露于PFOA改变了黄瓜叶片的代谢产物谱。

图5C中展示了可以区分对照组及PFOA处理组的共35种代谢物的VIP得分图。其中，具有清除ROS能力酚类物质（1、2、4 benzenetriol和1-hydroxyanthraquinone）和天然氨基酸（谷氨酸、谷氨酰胺、棕榈酸、苯丙氨酸和脯氨酸）发生了显著改变（p<0.05），表明PFOA干扰了黄瓜体内碳氮代谢，造成了氧化胁迫。

作者推断，黄瓜植株可能通过增加酚类物质的合成来应对PFOA诱导的氧化应激，保护细胞免受伤害。另外，苯丙氨酸是抗氧化次生代谢物的前体。苯丙氨酸的减少可能激活了抗氧化防御途径，与酚类物质上调所起的作用相一致。此外，天冬氨酸和谷氨酸是许多其他氨基酸的前体，且谷氨酸是高等植物氨基酸代谢的中心分子，调节铵态氮，也是叶片叶绿素合成的前体。谷氨酰胺和谷氨酸的减少可能可以解释叶绿素含量的减少（图3）。脯氨酸作为一种植物非生物和生物逆境的缓解剂，其减少可能会抑制蛋白质的生物合成，从而抑制植物的生长（图2）。

图5 | 经 0 (control)、 0.2 和 5 mg/kg PFOA处理的土壤栽培60天后黄瓜叶片代谢谱的得分图

4.PFOA扰动代谢通路

结果表明，低PFOA（0.2mg/kg）诱导扰动三个生物学途径，包括淀粉和蔗糖代谢、糖酵解和糖异生以及氨基糖和核苷酸糖代谢（表1）。所有这些被扰动的通路与糖代谢有关，表明碳固定通路改变响应PFOA的胁迫作用。相比之下，高PFOA（5 mg/kg） 时，淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢这两种代谢通路的扰动并不显著（p >0.05，表1）。然而，高PFOA扰乱了异喹啉生物碱的生物合成途径，产生生物碱，植物防御病原菌和食草动物不可缺少的化合物。此外，高PFOA还干扰了苯丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、酪氨酸代谢和丙酮酸代谢这4个与氨基酸代谢密切相关的生物通路。这些代谢途径的变化是氮和碳水化合物代谢的核心，为高PFOA如何抑制黄瓜生长和营养提供了可能的解释。

表1 | 0.2 mg/kg（低剂量）和5 mg/kg（高剂量）PFOA暴露使得黄瓜叶片中受影响的生物代谢通路

作者认为，较低剂量的PFOA及其盐类可以诱导主动防御反应，而高剂量的PFOA可以抑制黄瓜叶中的氨基酸。图6总结概括了糖代谢途径的原理图，图7归纳了经PFOA处理后受到影响的代谢物，展示了暴露于PFOA的黄瓜叶片中糖类、酚类化合物和氨基酸的变化。由此可见，植物体内碳水化合物、酚类物质和氨基酸代谢紊乱在黄瓜对PFOA胁迫的响应中起着重要作用，也是导致光合作用和生物量最终下降的可能原因之一。

图6 | 暴露于PFOA的黄瓜叶片中糖、酚类和氨基酸的代谢途径示意图

图7 | 暴露于PFOA的黄瓜叶片中糖、酚类和氨基酸类物质的改变

本文作者使用了GC-MS非靶向代谢组学方法，对全氟辛酸（PFOA）暴露土壤栽培的黄瓜组织代谢途径变化进行了研究。本研究通过光合特性和代谢组学分析，阐明了PFOA对植物的胁迫表现为抑制光合色素和光合速率、激活抗氧化酚和抑制天然氨基酸的代谢。该研究为了解植物响应非生物胁迫的分子机制提供了信息，为开发全氟辛酸（PFOA）毒性生物标记物提供了重要依据。

本文是一篇非常典型的使用GC-MS非靶向代谢技术研究应激条件下植物代谢途径的文章，作者系统地研究了在经PFOA处理的土壤中生长60天的黄瓜叶片发生的代谢途径重构，不仅考察了不同剂量水平PFOA暴露的影响，还特别研究了PFOA处理对黄瓜代谢产物特异性的影响。作者结合黄瓜生物量、光合指标分析及代谢分析，对PFOA引起的代谢物的差异进行了深入的研究，证据翔实，是一篇非常值得借鉴的非靶标代谢组学论文。

参考文献：

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Flora 撰文

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