项目文章 | TOP期刊!南京大学孙媛媛组仅使用GC-MS代谢组学就发表了IF=6.551文章

2021-06-28 18:13:23, 多层组学定制服务 上海鹿明生物科技有限公司


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● 前言


欧易/鹿明生物客户南京大学地球科学与工程学院孙媛媛教授团队在Science of the Total Environment期刊发表了题为Response of cucumber (Cucumis sativus) t o p e rfluorooctanoic acid in photosynthesis and metabolomics”的研究成果,该研究以土壤栽培的黄瓜(Cucumis sativus)为试验对象,运用GC-MS代谢组学研究了全氟辛酸(PFOA)对黄瓜的光合作用和抗氧化能力等的影响。并利用GC-MS对黄瓜组织进行代谢组学研究,揭示了全氟辛酸(PFOA)对植物毒性的机理,对于今后对农业土壤中全氟辛酸(PFOA)的风险评估提供了重要依据。



中文标题:黄瓜(Cucumis sativus)对全氟辛酸的光合作用和代谢组学响应

研究对象:黄瓜组织

发表期刊:Science of the Total Environment

影响因子:6.551

合作单位:南京大学地球科学与工程学院

运用关键技术:GC-MS非靶向代谢组学

文章中GC-MS非靶向代谢组学欧易/鹿明生物提供技术支持


● 研究背景


全氟辛酸(PFOA)是一种普遍存在的合成化学物质,其在工业、商业和人们的日常消费品中的广泛应用会引起严重的环境污染问题,最终威胁生态环境安全及人体健康。研究表明,PFOA在环境中长时间的停留可能会导致PFOA从土壤向作物的累积,转移并存储在各种植物器官中,从而影响作物生长。


目前对于PFOA的不利影响和风险的研究多集中在水生生态系统和动物实验上,对土壤中PFOA如何影响植物生长,以及植物如何应对PFOA胁迫的了解尚少。此外,研究发现PFOA积累可引起氧化应激,从而影响细胞代谢。但是,其潜在的毒性机制在很大程度上尚未明确,故需要对PFOA毒性的评估及其对陆地生态系统的潜在影响的能力进行深入探究。


研究技术路线


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实验方法


1.实验分组及前处理

从农田收集的土壤中施加0、0.2和5 mg/kg(土壤)的有放射性标记的PFOA-[1-14C] (14C-PFOA),添加了PFOA的土壤置于盆中进行黄瓜栽培,PFOA处理24 h后播种黄瓜种子。共有3种处理方式,包括对照组(无PFOA),0.2 mg/kg 的PFOA处理组,以及5 mg/kg 的PFOA处理组,每个处理组都有4个生物学重复(样本策略)。播种前采集土壤样品进行了放射性分析,0.2和5 mg/kg处理的PFOA初始浓度分别为0.22和4.82 mg/kg。


2.检验方法

(1)生物量测定:发芽60天后收获植株,洗净并分离成根、茎、叶部分,冻干后测定黄瓜生物量。

(2)PFOA含量检测:通过测量放射性14C来评估土壤和植物中PFOA的浓度;

(3)光合指标分析:用分光光度法测定叶片中叶绿素含量。用Li-Cor 6800便携式光合系统测定叶片的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率;

(4)代谢组学分析:GC-MS非靶向代谢组学


● 研究方法及结果


1.14C-PFOA的积累和黄瓜的生物量检测

14C-PFOA的积累:本研究采用14C放射性示踪剂跟踪植物组织对PFOA的吸收和转运。结果表明,即使在低浓度下,PFOA也会对土壤和植物产生影响(图1)。栽培土壤中添加PFOA的黄瓜的所有组织中都发现了14C标记的化学物质,叶片中含量最高,其次是根和茎。

图1 | 经 0 (control)、 0.2 和 5 mg/kg PFOA处理的土壤栽培60天黄瓜根、茎、叶中14C-化合物浓度


黄瓜的生物量检测:PFOA处理下黄瓜的平均生物量均低于对照组(图2),但0.2 mg/kg和5 mg/kg处理之间的生物量差异并不显著,说明影响黄瓜生长的因素除剂量效应外,还有其他因素。

图2 | 经 0 (control)、 0.2 和 5 mg/kg PFOA处理的土壤栽培60天后黄瓜根、茎、叶的干重


2.黄瓜对PFOA的光合响应

为了解叶片中全氟辛酸的积累对叶绿素含量和光合作用影响,进行了光合指标的分析。结果表明, 与对照相比,PFOA显著降低了光合色素(Chl a、Chl b和Caro)的含量(图3)。另外,通过气体交换分析,评价了光合作用对PFOA的响应。结果表明,经PFOA处理的叶片,其细胞间CO2浓度(Ci;图4B)、蒸腾速率(Tr;图4C)或气孔导度(Gs;图4D)并无显著性差异。但是,在经0.2 和 5 mg/kg PFOA处理的黄瓜中发现净光合速率下降。与PFOA处理过的生物量变化相同,经0.2 mg/kg和5 mg/kg处理的叶绿素含量和净光合速率的差异并不显著。

图3 | 经 (control)、 0.2 和 5 mg/kg PFOA处理的土壤栽培60天后黄瓜叶片中叶绿素(Chl, mg/g鲜重)含量


作者推测,叶绿素含量降低和净光合速率降低可以解释经PFOA 处理的黄瓜生物量减少。在PFOA胁迫下,黄瓜植物可能会遭受活性氧(ROS) 信号级联反应,导致光合作用下降,从而使得生长受限。

图4 | 经 0 (control)、 0.2 和 5 mg/kg PFOA处理的土壤栽培60天后黄瓜叶片


净光合速率(A;Pn;μmol m−2ss−1),细胞间CO2浓度(B;Ci;μmol mol−1),蒸腾速率(C;Tr;mmol m−2s−1)和气孔导度(D;Gs; mmol m−2s−1


3.黄瓜对全氟辛酸(PFOA)的代谢响应

作者认为,上述叶绿素及光合指标等的生理变化可能源于细胞内代谢变化。作者使用GC-MS非靶向代谢组学方法,总共鉴定出191种代谢物,基于质谱指纹和保留指数匹配对它们进行半定量。使用MetaboAnalyst通过主成分分析(PCA)进行了无监督的聚类分析。结果表明,低PFOA组(0.2 mg/kg)与对照组之间没有明显的分离。然而,高PFOA组(5 mg/kg)在第一主成分(PC1) 上与对照组明显分离,解释率为23.8%。此外,在PCA模型中,0.2 mg/kg和5 mg/kg PFOA之间没有明显的分离。通过有监督的分类模型,低剂量和高剂量PFOA组与对照组明显分离(图5B)这表明暴露于PFOA改变了黄瓜叶片的代谢产物谱。


图5C中展示了可以区分对照组及PFOA处理组的共35种代谢物的VIP得分图。其中,具有清除ROS能力酚类物质(1、2、4 benzenetriol和1-hydroxyanthraquinone)和天然氨基酸(谷氨酸、谷氨酰胺、棕榈酸、苯丙氨酸和脯氨酸)发生了显著改变(p<0.05),表明PFOA干扰了黄瓜体内碳氮代谢,造成了氧化胁迫。


作者推断,黄瓜植株可能通过增加酚类物质的合成来应对PFOA诱导的氧化应激,保护细胞免受伤害。另外,苯丙氨酸是抗氧化次生代谢物的前体。苯丙氨酸的减少可能激活了抗氧化防御途径,与酚类物质上调所起的作用相一致。此外,天冬氨酸和谷氨酸是许多其他氨基酸的前体,且谷氨酸是高等植物氨基酸代谢的中心分子,调节铵态氮,也是叶片叶绿素合成的前体。谷氨酰胺和谷氨酸的减少可能可以解释叶绿素含量的减少(图3)。脯氨酸作为一种植物非生物和生物逆境的缓解剂,其减少可能会抑制蛋白质的生物合成,从而抑制植物的生长(图2)


图5 | 经 0 (control)、 0.2 和 5 mg/kg PFOA处理的土壤栽培60天后黄瓜叶片代谢谱的得分图


(A)主成分分析(PCA)和(B)偏最小二乘判别分析(PLS-DA)以及(C)VIP得分图。


4.PFOA扰动代谢通路

结果表明,低PFOA(0.2mg/kg)诱导扰动三个生物学途径,包括淀粉和蔗糖代谢、糖酵解和糖异生以及氨基糖和核苷酸糖代谢(表1)。所有这些被扰动的通路与糖代谢有关,表明碳固定通路改变响应PFOA的胁迫作用。相比之下,高PFOA(5 mg/kg) 时,淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢这两种代谢通路的扰动并不显著(p >0.05,表1)。然而,高PFOA扰乱了异喹啉生物碱的生物合成途径,产生生物碱,植物防御病原菌和食草动物不可缺少的化合物。此外,高PFOA还干扰了苯丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、酪氨酸代谢和丙酮酸代谢这4个与氨基酸代谢密切相关的生物通路。这些代谢途径的变化是氮和碳水化合物代谢的核心,为高PFOA如何抑制黄瓜生长和营养提供了可能的解释。


表1 | 0.2 mg/kg(低剂量)和5 mg/kg(高剂量)PFOA暴露使得黄瓜叶片中受影响的生物代谢通路


作者认为,较低剂量的PFOA及其盐类可以诱导主动防御反应,而高剂量的PFOA可以抑制黄瓜叶中的氨基酸。图6总结概括了糖代谢途径的原理图,图7归纳了经PFOA处理后受到影响的代谢物,展示了暴露于PFOA的黄瓜叶片中糖类、酚类化合物和氨基酸的变化。由此可见,植物体内碳水化合物、酚类物质和氨基酸代谢紊乱在黄瓜对PFOA胁迫的响应中起着重要作用,也是导致光合作用和生物量最终下降的可能原因之一。

图6 | 暴露于PFOA的黄瓜叶片中糖、酚类和氨基酸的代谢途径示意图

图7 | 暴露于PFOA的黄瓜叶片中糖、酚类和氨基酸类物质的改变


研究结论


本文作者使用了GC-MS非靶向代谢组学方法,对全氟辛酸(PFOA)暴露土壤栽培的黄瓜组织代谢途径变化进行了研究。本研究通过光合特性和代谢组学分析,阐明了PFOA对植物的胁迫表现为抑制光合色素和光合速率、激活抗氧化酚和抑制天然氨基酸的代谢。该研究为了解植物响应非生物胁迫的分子机制提供了信息,为开发全氟辛酸(PFOA)毒性生物标记物提供了重要依据。


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本文是一篇非常典型的使用GC-MS非靶向代谢技术研究应激条件下植物代谢途径的文章,作者系统地研究了在经PFOA处理的土壤中生长60天的黄瓜叶片发生的代谢途径重构,不仅考察了不同剂量水平PFOA暴露的影响,还特别研究了PFOA处理对黄瓜代谢产物特异性的影响。作者结合黄瓜生物量、光合指标分析及代谢分析,对PFOA引起的代谢物的差异进行了深入的研究,证据翔实,是一篇非常值得借鉴的非靶标代谢组学论文。


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参考文献:

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Flora 撰文

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