快问快答——10分钟解决空间代谢组学最关心的疑虑!

2021-06-15 19:13:08, 多层组学定制服务 上海欧易生物医学科技有限公司


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1.空间代谢组如何实现对代谢物的定性以及验证工作?

做空间代谢组,鹿明生物采用空间成像仪器(AFADESI-MSI)对两张切片(正负离子模式各一张组织切片)进行扫描和信息采集。获得切片上代谢物的m/z,通过与数据库进行比对,获得代谢物的定性标注信息,并利用空间成像软件解析获得不同m/z的空间成像图。


我们根据不同m/z的成像图,并且参考统计分析、通路富集分析,找到感兴趣的目标物质。后续可针对感兴趣的目标物质通过对切片进行原位二级验证,或者也可通过IHC、PRM等方式在酶的层面进行验证。

2.鹿明生物的空间代谢组都有哪些空间分辨率,是否分辨率越高越好?

AFADESI-MSI的空间分辨率(即一个像素点的尺寸大小)目前有100um*100um,40um*40um,20um*20um,鹿明生物也在不断研发更高的空间分辨率。我们要根据自己关注的组织微区大小去选择合适的分辨率,并非分辨率越高就越好。


比如对于脑组织、肾脏组织、心脏组织等样本经过切片后尺寸在1cm*1cm左右,关注的微区结构利用100um*100um就能够很好满足自己的实验需求,那么我们没有必要选择更高分辨率去做。分辨率越高,意味着成本也会更高。


对于一些小体积样本,比如样本尺寸在5mm*5mm以下,为了获得足够的像素点,形成更佳清晰的成像图,并且关注的组织微区需要更高的分辨率才能获得足够的信息,那么我们可以去选择更高的空间分辨率来完成自己的实验目的。

3.能否介绍一下鹿明空间代谢组所用的数据库,对于数据库里没有的物质如何实现定性?

空间代谢组与常规代谢组对于代谢物的定性需要通过与数据库匹配来获得定性信息。鹿明生物拥有2个空间代谢组自建库:一个专门针对人和动物,目前拥有4000+的代谢物信息,包括胆碱类、多胺类、氨基酸类、肉碱类、核苷类、核苷酸类、有机酸类、碳水化合物类、胆固醇类、胆酸类、脂质类等多个种类代谢物;


另一个专门针对植物,目前拥有6000+的代谢物信息,涵盖生物碱类、酚酸类、黄酮类、香豆素类、苯丙素类、木脂素、萜类等10大类代谢物。


数据库的建设经过文献、公共数据库、标准品、人工校对等去增加定性的可靠性。通过数据库的对比,目前依然存在一定量的未知物存在。随着数据库的扩增,未知物的数量会逐渐下降,但未知物的存在是必然的情况,另外对于未知物的确定还需要结合其他的技术去做出鉴定。

4.空间代谢组对于生物学重复的要求?

大/小鼠的生物学重复建议≥3个,大型动物的生物学重复建议≥5个,临床样本的生物学重复建议≥5个 


5.如何根据代谢物的变化鉴定代谢酶?

通过空间代谢组获得的成像图找到具有异质性分布的代谢物,并结合统计学分析和通路富集分析等进一步确认自己的目标代谢物。可以通过原位二级对代谢物定性信息进行验证后,利用IHC、WB、PRM等手段对关键的酶进行鉴定。

6.空间代谢组学在中药或植物领域可以有哪些方向的应用?

在中药方向的应用:如:1)中药成分的药物靶向性研究;2)药物毒性机制研究;3)中药药用成分定位等。


在植物领域的应用:如:1)发育学,如种子、胚胎、器官发育过程中的空间代谢调控等;2)分子机制,如盐胁迫、病毒/真菌侵染、光合作用等机制研究;3)基因调控机制,如转基因、基因沉默、基因敲除后代谢物变化的机制研究,了解基因与代谢物之间的精确关系等;4)植物与环境互作研究,如昆虫选择性侵害植物部位、土壤与根部互作研究等;


7.空间成像的分辨率和定性的准确性哪个更重要?

两个都重要。空间分辨率并非越高越好,要选择能够满足自己研究目的,经费上又可控的空间分辨率。空间代谢组主要解决的是代谢物的空间定位问题,通过非靶向的方式获得具有空间异质性分布的m/z,后续针对目标m/z通过原位二级进行验证。


8.你们的AFADESI-MSI仪器可以检测蛋白和多肽吗?

鹿明生物的AFADESI-MSI空间代谢组技术是专门针对小分子代谢物的成像技术,聚焦在70-1000Da之间的物质检测,不能检测蛋白或者多肽。


9.临床样本尺寸比较大,如何确保选取的组织是病灶部位?是根据HE染色吗?

是的,通过HE染色。做空间代谢组学,在上机前,公司都会对一张切片进行HE染色,确定了结构后才会将连续切片上机进行扫描以及后续的分析。另外对于肿瘤组织做空间代谢组,无需将癌和癌旁分割后再送样,可以利用空间代谢组对一整块的组织(包括癌和癌旁)实现同时成像。


10.请问鹿明空间代谢组成像图的分辨率有多高,是否能到单细胞水平,分辨率的高低取决于探针的大小吗?

AFADESI-MSI的空间分辨率(即一个像素点的尺寸大小)目前有100um*100um,40um*40um,20um*20um。对于一些较大的细胞,较高的分辨率可以到单细胞的水平,但是对于一些只有几um的细胞,就到不了单细胞水平了。分辨率的大小不仅取决于喷针的大小,还跟硬件、软件的参数设置等都有关系。

11.植物空间代谢组如何实现定性?目前关于植物次级代谢库还不够丰富,有何种方法?

无论是动物的还是植物的空间代谢组学,定性都是需要基于数据库。鹿明生物现在有两个自建空代数据库一个专门针对人和动物,一个专门针对植物。植物空代数据库目前拥有6000+的代谢物信息,涵盖生物碱类、酚酸类、黄酮类、香豆素类、苯丙素类、木脂素、萜类等10大类代谢物,次生代谢物占绝大部分。


12.您这个离子源相比desi和MALDI最大优势是什么?

MALDI成像最大的优势是可以做到5um的空间分辨率,对于不同的样本尺寸,也可以采用不同的空间分辨率去成像,分辨率越高成本也会越高。常规1平方厘米大小的组织片,如果用100um*100um的分辨率打质谱,预计需要120min,如果用5um*5um的分辨率打质谱且不损失空间信息的情况下,预计需要48000min才能打完一个样本,这样的成本是极高的。另:MALDI需要基于基质,检测的物质偏向于蛋白、多肽和脂质。


DESI技术可以在一张片子上实现HE染色和空间代谢物成像,有文献报道做完DESI的切片还可以再拿去做MALDI,MALDI还能将DESI中没有解析出来的代谢物进一步解析后成像。


AFADESI-MSI技术聚焦在小分子代谢物的成像上,主要检测的是70-1000Da之间的代谢物,包括胆碱类、多胺类、氨基酸类、肉碱类、核苷类、核苷酸类、有机酸类、碳水化合物类、胆固醇类、胆酸类、脂质类等。对于切片上代谢物的解析较为完全,切片经过AFADESI-MSI解析后不能再用作其他实验。并且AFADESI-MSI的成像不借助基质,可以对小体积的样本甚至整只小/大鼠的切片进行空间成像。


13.AFADESI-MSI能对非极性的化合物进行检测吗?

AFADESI-MSI对于分子量在70-1000Da之间的极性和非极性物质有一个较好的覆盖,检测的物质类型见上述问题。可以通过鹿明生物微信公众号留言索要AFADESI-MSI进行空间代谢组研究的相关文献,查阅其中检测到的物质类型。


今年3月份基于AFADESI-MSI检测脑组织中的神经递质以及极性物质的文章发表在analytical chemistry上,在本实验中并非只检测到极性物质,也同时检测到许多非极性物质。由于研究者对于神经递质以及极性物质有较浓厚的兴趣,因此将关注点放在这类物质的阐述上。


鹿明生物 /

上海鹿明生物科技有限公司多年来,一直专注于生命科学和生命技术领域,是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过多年的发展沉淀,公司建立起了4D-DIA/LFQ/PRM、iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和空间代谢组学、全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组、精准靶向等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台。


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