打破“内卷”循环，后核酸组学时代的单细胞蛋白组学，你敢迈出这步吗？

随着二代测序技术的持续发展，单细胞基因组和转录组研究突飞猛进，使学者们对细胞认识的分辨率大大提高。然而仅依靠单细胞的基因组和转录组数据，对理解细胞在人体复杂环境中的表型和功能还远远不够。蛋白质作为细胞内生物功能的直接执行者，通过蛋白质及其翻译后修饰的动态变化，可以感知并响应外在和内在的刺激，从而影响整个生命体的功能和状态。因此单细胞蛋白质组受到研究者们越来越广泛的关注，是目前及未来重点研究的热点之一。

本文为2021年美国东北大学的Nikolai Slavov教授团队在Genome Biology期刊上发表了题为“Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2”的研究论文。该研究采用Minimal ProteOmic sample Preparation (mPOP)样本处理和TMT标记方法，优化了单细胞蛋白质组（SCoPE-MS)的实验流程，进而对单个哺乳动物细胞进行质谱分析，量化细胞分化过程中的单细胞蛋白质丰度和异质性。研究中SCoPE2可以在10天的仪器时间内对1490个单核细胞和巨噬细胞中的3042种蛋白质进行定量，这些定量的蛋白质使我们能够按细胞类型区分单细胞。

细胞是生命体的最小组成单位，遗传及外部环境等因素使单个细胞异质性广泛存在于众多生物体中，而组织和器官由功能特化的细胞组成，单细胞的这种特化通常源于介导生理功能的蛋白质网络。然而，目前在单细胞中全面量化构成这些网络的蛋白质的能力仍然相对有限。因此，单细胞中的蛋白质水平通常是从间接替代品中推断出来的——从它们相应的 mRNA 中读取序列。

现有的单细胞 RNA 测序方法中 scRNA-seq 协议捕获了细胞中大约 10-20% 的分子，因此对于许多转录本而言，所得到的样本非常稀少，并且许多转录本以低拷贝数存在。因此，对 mRNA 丰度的估计明显受到采样（计数）误差的影响。而大多数蛋白质在每个细胞中的拷贝数是其相应转录本的 1000 多倍。因此，蛋白质的高拷贝数可能允许在没有扩增的情况下对其进行定量。然而，大多数用于定量单细胞蛋白质的技术都依赖于抗体，其特异性有限。尽管串联质谱 (MS/MS) 与液相色谱 (LC) 和电喷雾电离 (ESI) 相结合，已经能够对大量样品中的蛋白质进行准确、高特异性和高通量的定量，但其在单细胞中的应用处于起步阶段。

为了将这些强大的 MS 技术应用于单细胞分析，该团队开发了质谱法单细胞蛋白质组学。 该方法引入了等压载体的概念，它具有三个重要作用：(i) 减少样品损失；(ii) 在MS1 调查扫描期间增强离子的可检测性；(iii) 为肽序列鉴定提供碎片离子。通过将这一概念与 MS 兼容的细胞裂解相结合，作者确定了应用多重 LC-ESI-MS/MS 来量化单个细胞蛋白质的可行性。

该研究彻底检查了多个实验步骤，包括细胞分离、裂解和样品制备。此外，该实验优化 MS 数据采集的方法（DO-MS；数据驱动的 MS 优化）以及在获得后解释这些数据。例如，用于增强肽识别的DART-ID技术（数据驱动的保留时间对齐）。将这些进步与SCoPE2 相结合，显著提高了定量和通量。

SCoPE2的总体工作流程如下图所示。单个细胞被分离在单独的孔中，进行裂解，并将其蛋白质消化成肽。来自每个单个细胞的肽串联质谱标签(TMT)共价标记，因此，具有相同序列(和质量)的标记肽在MS1扫描中显示为相同m/z的峰，质谱仪器会将这些峰分离并将其进一步碎裂。除了产生有助于肽段鉴定的片段外，碎片还产生报告离子(RI)，其丰度反映相应样本(单细胞)中的蛋白质丰度。

图1 | SCoPE2技术的单细胞捕获和工作流程

裂解物中的蛋白质用胰蛋白酶消化；所得肽经TMT标记后用LC-MS/MS分析。SCoPE2集包含参考通道。以DO-MS优化LC-MS/MS分析，用DART-ID来加强对肽段的鉴定。

SCoPE2相对于SCOPE-MS的主要进展

接下来作者开始进行单细胞蛋白组学分析测试：制作100xM的standard样本，其中分为5000细胞的对照和100的单细胞组（图2b），测试使用1xM样本，发现50细胞左右的蛋白比与单个细胞的蛋白比的相关性为0.84（图2c），并且能做到很好的一致性（50个细胞和单细胞）与分群（不同类型细胞）（图2d）。

图2 | 单细胞蛋白质组学分析测试

在确认单细胞流程可用后，作者将其应用到细胞分化中：

在观察到数据质量和结果良好后，作者将流程用于细胞分群：

作者通过分析单核细胞和巨噬细胞大量样本所确定的差异显著的蛋白质丰度的中位数对每个细胞进行了颜色编码。得到的结果与它们的细胞类型一致，从而支持了SCoPE2数据可用于对细胞类型进行分类。

测试表明，SCoPE2流程可用于细胞类型的分类。

核心技术：单细胞蛋白质组学质谱技术（Single-Cell ProtEomics by Mass Spectrometry，SCoPE-MS）：在蛋白组学技术中引入等压载体概念，实现高通量、低成本蛋白质组学测定。本研究中研究人员进一步对多个实验步骤进行了改进形成SCoPE2，并开发了MS数据获取的优化方案（DO–MS; Data-driven Optimization of MS）、数据解读方案（(DART-ID; Data-driven Alignment of Retention Times for IDentification），从而提高检测通量和定量准确性、改善不同单细胞之间的数据整合、促进肽段序列鉴定。

同时，作者能够描述骨髓细胞分化过程中出现的异质性，并探索调控相互作用。所描述的方法学是通用的，可广泛应用于推动描述性单细胞研究向分子机制的定量探索方向发展。

参考文献

Specht, H., et al. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biol 22, 50 (2021).

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天云岚撰文

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