项目文章 | 6连发！“生长进化论”西南科技大学罗学刚组探究爆炸物对苜蓿中的生物降解和植物毒性机制

2021年5月，欧易/鹿明生物客户西南科技大学罗学刚教授团队在Chemosphere期刊发表了题为“Analysis of the biodegradation and phytotoxicity mechanism of TNT, RDX, HMX in alfalfa (Medicago sativa)”的研究成果，通过LC-MS非靶向代谢组学研究方法，探索了爆炸物暴露对植物的毒性机制，描绘了在三种爆炸物影响下苜蓿代谢组图谱，为环境污染物毒理学研究提供了新思路和方法。

环境中爆炸物（炸药）可造成土壤和水的污染，已引起科学家的关注。植物修复是解决环境中爆炸物土壤污染的有效手段之一。苜蓿等植物可以吸收和转化土壤中的爆炸物，但爆炸物对植物有显著的毒性作用，降低了植物从土壤或水中吸收和转化爆炸物的能力。因此充分了解爆炸物在植物中的毒性机制是提高爆炸物污染场地植物修复效率的重要前提。有研究表明污染物会干扰光合作用、影响抗氧化酶活性，但爆炸污染物（TNT、RDX 和 HMX）对植物叶绿素荧光生理、抗氧化酶活性和毒理学机制的综合影响尚不清楚。本研究通过叶绿素荧光分析、傅里叶变换红外光谱 (FTIR)、抗氧化酶活性分析和非靶向代谢组学研究了暴露在典型爆炸物（TNT、RDX 和 HMX）的苜蓿潜在毒性机制，验证了植物体内被降解的TNT、RDX 和 HMX残留物和中间产物干扰植物正常生理代谢的假设。

1.实验分组

①种子萌发对比试验：无炸药对照组、TNT处理组、RDX处理组、HMX处理组、混合处理组（每组50颗种子）

②水培试验：无炸药对照组、TNT处理组、RDX处理组、HMX处理组、混合处理组（正常萌发后50天后炸药处理72小时，每组5个生物学重复）

2. 植物生长与形态分析

记录植物生长状态、叶片氮含量测定、扫描电镜评估植物根系形态、傅里叶红外光谱对根系干燥粉末进行官能团分析。

3.生理参数测定

叶绿素荧光参数、抗氧化酶活性及MDA含量

4.LC-MS非靶向代谢组

5.其它

水培液中爆炸物残留量检测.

1.植物生长、爆炸物累积和根系微观结构分析

用不同炸药处理72小时后苜蓿的生长状况如图 1A 所示。TNT 组和混合组植物的根颜色明显比对照组深，而 RDX 和 HMX 组几乎没有变化。爆炸物暴露下，紫花苜蓿种子的发芽率和发芽活力受到显著抑制（图1B-C）。扫描电子显微镜结果显示，与对照组相比TNT 组和混合组的根部微观结构发生显著变化，RDX 和 HMX 组的根部损伤较少（图 1F-J）。

图1 | TNT / RDX / HMX暴露对植物的影响

红外光谱结果（FTIR）证实暴露于爆炸物的植物根部没有任何新吸收峰，但峰形发生变化，酰胺II基团、脂质和多糖基团吸收峰的变化证明核酸是参与富集的重要有机物，炸药溶液与苜蓿根细胞壁上的蛋白质、多糖和脂质发生反应，进入细胞参与细胞代谢（图2）。

图2 | 暴露于TNT / RDX / HMX的苜蓿根FTIR分析

2.爆炸物暴露对植物光合特性的影响

如图 3所示，与对照组相比，TNT 组和混合组植物的叶绿素 a 含量显著降低，而 RDX 和 HMX 组没有显著变化。HMX组的叶绿素 b 含量显著增加，而混合组显著降低（图 3B）。不同处理组的光合荧光生理参数如图 3C-I 所示。总之TNT 和混合组植物的荧光生理参数受到显著影响，但 RDX 和 HMX 组没有显示出显著变化。

图3 | TNT / RDX / HMX暴露对苜蓿叶片叶绿素荧光参数的影响

3.爆炸物暴露对植物根系抗氧化酶系统的影响

植物抗氧化酶对爆炸物暴露的反应如图 4 所示。与对照组相比，不同处理组的 SOD 活性受到显著抑制（图4A）；POD 活性在不同治疗组中表现出差异（图4B）；TNT 组中的 CAT 活性没有明显变化，而 RDX、HMX 和混合组中的 CAT 活性显著降低（图4C）。在所有爆炸物暴露组，PRO 含量显著降低（图 4D）。总之炸药暴露降低了苜蓿的抵抗力和抗氧化活性。

炸药暴露后，TNT、RDX、HMX 和混合组中 MDA 和ROS含量显著增加（图 4E和F），表明暴露对苜蓿造成过氧化损伤并破坏细胞膜脂质结构。这可能是苜蓿利用过氧化物酶体氧化分解炸药的证据；但也会造成细胞过氧化损伤，所以根部出现明显的中毒症状。

图4 | 苜蓿根抗氧化酶系统对TNT / RDX / HMX暴露的响应

4.爆炸物暴露的植物根部的代谢特征

本文研究使用LC-MS非靶向代谢组学共鉴定出 6185 种代谢物。主成分分析（PCA）显示，与Control组相比，TNT组和混合组的代谢谱聚集位置变化显著，但RDX组和HMX组变化很小（图5A）。使用 OPLS-DA 模型可得知，与对照组相比，TNT组有 609个DEM（189个上调，420个下调），RDX 组有197个DEM（155个上调，42个下调），HMX 组有234个DEM（132个上调，102个下调），混合组有512个DEM（176个上调，336个下调）（VIP > 1，P < 0.05）（图5B-E）。在用不同炸药处理组中，有12个差异代谢物是共有的，可用作潜在生物标志物（图5F），上调的共有代谢物包括 3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚 (Trp-P-1)、去甲藻酸C、絮凝素、脯氨酸甜菜碱、异戊二烯糖苷和顺反-叶绿素，其他代谢物显著下调。

图5 | 在TNT / RDX / HMX暴露下苜蓿根的代谢轮廓

5.差异代谢物的表达模式分析

如图6A所示，在不同爆炸物暴露条件下，植物根系的差异代谢物主要是脂质和类脂质分子，它们的异常代谢可能是细胞毒性的原因之一。其他代谢物是有机酸及其衍生物和有机氧化合物。进一步分类发现主要的脂质和类脂质代谢物是脂肪酰基、异戊烯醇脂质和甘油磷脂（图 6B），映射到 KEGG 代谢途径数据库共鉴定出25 种。分析发现TNT组和混合组表现出高度的一致性，包括山萮酸、3-磷酸甘油和甘油磷酸胆碱代谢物的异常表达。RDX组显示2-异丙基苹果酸和γ-亚麻酸的上调，而 HMX 组显示 5-氨基戊酸十六烷二酸和棕榈醛的表达异常。

图6 | 分析差异表达代谢物（DEM）的表达模式

6.差异代谢物的代谢途径分析

差异代谢物富集途径的气泡图如图 7A 所示。TNT组和混合组的代谢途径富集高度一致，主要途径是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘油磷脂代谢和光合生物中的碳固定。RDX组的富集途径主要是精氨酸生物合成和氨酰-tRNA生物合成，HMX组的富集途径是氧化磷酸化、甘油磷脂代谢和嘧啶代谢。维恩图显示了不同暴露组的代谢物富集途径的相互作用，并确定7种常见的富集途径（图 7B），即 ABC 转运蛋白、黄酮和黄酮醇生物合成、萜类骨架生物合成、磷酸戊糖途径、亚油酸代谢、嘌呤代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢途径（图7C）。综上所述，这些代谢途径的异常表达可能是爆炸物暴露后观察到的植物毒性的原因之一。

图7 | 差异表达代谢物（DEM）的代谢途径分析

7.爆炸物改变植物根系的基本代谢网络

爆炸物对根细胞初生代谢网络的毒性作用见图8（包括碳水化合物、脂类和氨基酸）。TNT组和混合组的表达模式高度一致。

在碳水化合物代谢中，TNT 组和混合组引起 3-磷酸甘油醛、葡糖醇溶菌素 、FGAM 的代谢上调和D-果糖-6P、N-乙酰甘露糖胺-6P、葡糖酸内酯和假尿苷 5''-磷酸的下调。RDX 暴露导致L-岩藻糖、N-乙酰甘露糖胺-6P 和脱氧核糖上调。HMX暴露导致细胞内脱氧核糖代谢上调 。

在脂肪酸代谢途径中，TNT组和混合组引起山萮酸上调和9,10,13-TriHOME下调。RDX组诱导 2-异丙基苹果酸代谢上调。HMX 组中，十六烷二酸、9,12,13-TriHOME、5-氨基戊酸酯和棕榈醛上调。

在氨基酸代谢途径中，TNT组和混合组显示出天冬氨酸、天冬酰胺、葡糖二酸、谷氨酸、L-异亮氨酸和氨基葡萄糖 6-磷酸下调。RDX 组显示 L-天冬酰胺、精氨酸和鸟氨酸代谢上调。

图8 | 苜蓿植物根系中的碳水化合物，氨基酸和脂质代谢网络

苜蓿是一种多年生开花植物，对各种非生物胁迫具有广泛的抗性，因此本文研究了不同炸药对苜蓿的毒性。种子萌发时对周围环境高度敏感，暴露在三种炸药中会导致苜蓿种子的发芽率和发芽潜力显著降低，从而破坏植物根系（图1）。FTIR 光谱的结果解释了这种毒性，这表明爆炸物暴露会引起细胞脂质和蛋白质的变化（图 2），可能还会破坏正常的细胞代谢。

叶绿素荧光参数可反映受爆炸物毒害的植物光合作用变化。本研究发现TNT 处理和混合炸药处理导致植物 Fv/Fm 降低，反映植物叶片健康恶化和光合作用减少，此外qN 和 NPQ 的增加反映了氧化应激的减轻和能量耗散机制的激活。但暴露于RDX和HMX，叶片光合系统并没有显著改变，表明苜蓿在这种暴露下具有一定耐受性（图3）。同时发现HMX处理后植物叶片的叶绿素b含量和N含量显著增加，推测 HMX暴露可能从植物根部转移到叶子，并参与了植物生长和代谢。

植物抗氧化酶系统在应对各种胁迫和清除自由基方面发挥着关键作用。此前的研究表明，苜蓿植物会激活自身的防御机制来应对逆境。当暴露于爆炸物时，植物会产生一系列物质，包括氧自由基、膜脂过氧化物、过氧化物，这些物质会破坏细胞膜的结构和功能。在本研究中，RDX、HMX和混合炸药处理导致植物根部CAT酶活性显著降低。SOD酶活性在所有炸药处理后显著降低，反映植物清除氧自由基以防止氧化损伤的能力降低，因此植物生长受到抑制。TNT和RDX处理增加了植物POD酶活性，表明植物在爆炸物暴露时作为防御反应可以增加POD活性，从而减少爆炸物及其转化产物造成的损害。但混合处理组POD 酶降低，反映植物的防御系统可能已经不堪重负和损坏。

脯氨酸（PRO）是一种理想的渗透调节剂，在抵抗环境压力方面起着重要作用。三种炸药及其混合物对苜蓿根PRO含量显著降低，表明植物细胞和酶被破坏。同样，MDA含量是毒性和保护作用的综合反映。本研究中，植物根系暴露于炸药及其混合物后MDA含量显著增加，表明植物体内以各种非酶和抗氧化酶为代表的抗氧化系统不能抵抗氧化应激，也无法消除消除爆炸物暴露引起的自由基损伤（图4）。苜蓿可能利用过氧化物酶氧化诱导炸药分解，但会造成细胞过氧化损伤，所以根部出现明显的中毒症状。

代谢组学可以揭示内源性物质的变化水平以及生物体在压力下调用的分子毒理学机制。植物应对 TNT、RDX和HMX暴露的反应策略似乎相同。代谢物的主要差异在于脂质和类脂分子、有机酸及其衍生物、有机氧化合物，这些都反映了植物脂质代谢和碳代谢的失衡，可能指向潜在的植物毒性耐受机制（图6）。TNT组和混合组的谷胱甘肽含量受到显著抑制，进一步表明植物的抗氧化功能受损。此外一些差异代谢物也受到类似影响，例如Trp-P-1的表达显著上调，该物质已被证明具有强烈的诱变作用，表明接触爆炸物会增加植物的突变。脯氨酸甜菜碱是一种极好的渗透压保护剂，接触爆炸物会导致该物质的表达减少，表明植物根部的渗透调节功能丧失（图 5）。

然而不同炸药对植物根系代谢途径的影响也存在差异。例如TNT 暴露影响了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及甘油磷脂代谢的代谢途径，表明植物自身的能量供应受到TNT暴露的不利影响。RDX暴露导致精氨酸生物合成和氨酰 tRNA 生物合成所涉及的代谢途径异常，表明植物氮代谢受到干扰。HMX 暴露导致氧化磷酸化和甘油磷脂代谢的代谢途径失衡，反映磷脂信号通路在植物对HMX的反应机制中起关键作用（图 7）。在氨基酸代谢途径中，TNT组和混合组显示天冬氨酸、天冬酰胺、葡糖二酸、谷氨酸、L-异亮氨酸和氨基葡萄糖6-磷酸代谢的下调。RDX组显示L-天冬酰胺、精氨酸和鸟氨酸代谢上调。

根据本文的发现，构建了植物根系对爆炸物的初生代谢反应网络（图8）。在 TCA 循环中，用 TNT 和炸药混合物处理导致苹果酸代谢受到抑制，苹果酸代谢是一种在调节植物生长和气孔孔径方面发挥重要作用的代谢物。在碳水化合物代谢中，不同炸药对脱氧核糖代谢的影响不同。TNT 暴露导致这种新陈代谢的下调，表明细胞分裂受到损害。但RDX和HMX 暴露导致脱氧核糖代谢上调，表明细胞启动了一种特定的防御机制，增强了细胞分裂和分化对RDX和HMX毒性的抵抗力。L-岩藻糖生物合成在植物气孔功能、质外体防御和触发免疫中起重要作用。RDX暴露诱导了植物L-岩藻糖的上调。在脂质代谢中，三种炸药引起脂肪酸代谢失衡。包括蒌烯酸、山萮酸、5-氨基戊酸和2-异丙基苹果酸在内的脂质代谢物通过愈伤组织的形成和提高植物免疫力在植物抗逆性中发挥重要的生理功能。在氨基酸代谢中，用 TNT 和炸药混合物处理导致该代谢途径的整体抑制。氨基酸（包括天冬氨酸、谷氨酸和异亮氨酸）的代谢受到抑制，表明植物无法合成蛋白质并调用抵抗外部毒素所需的防御策略。此外RDX暴露增加了精氨酸和鸟氨酸的代谢，可进一步形成多胺和NO，可用于调动植物氮的储存并微调发育和抵御胁迫的机制。总之，TNT、RDX 和 HMX 暴露导致植物基础代谢网络的失衡。

在水培条件下，TNT暴露可引起植物根系微观结构和叶绿素荧光参数的变化，而RDX和HMX暴露仅引起很小的变化。三种炸药及其混合物均引起抗氧化酶系统紊乱，植物分泌的水解酶可降解TNT、RDX和HMX。代谢组学结果表明，三种炸药主要引起植物根系脂质和类脂分子代谢失衡。其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成和氧化磷酸化代谢途径与炸药的生物转化密切相关。同时爆炸物造成植物根系初生代谢失衡。该研究为分析爆炸物对植物造成中毒的毒性机制提供了一种分析方法，为环境中污染物爆炸物的管理提供了科学依据。

代谢组学技术已经成为研究植物抗逆分子机制不可或缺的手段，对于非生物污染物暴露的研究尤其如此。本文的研究结果可为环境污染物对植物影响提供科学依据和参考。而作者在研究对象的选择、实验方案的设计、研究手段的选取以及代谢组数据的解析方面均有独到之处。文章简洁明晰，结构合理，图表丰富充实，是一篇运用代谢组学进行抗逆研究的典型文章示例，也值得进行相关领域的研究人员借鉴。

参考文献：

1.      Li, H.X., Xiao, Y., Cao, L.L., Yan, X., Li, C., Shi, H.Y., Wang, J.W., Ye, Y.H., 2013.
Cerebroside C increases tolerance to chilling injury and alters lipid composition in wheat roots. PloS One 8, e73380. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0073380.

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嫣然 撰文

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