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2021年9月，安徽农业大学张照亮教授课题组在Journal of Agricultural and Food Chemistry期刊发表了题为“Nitrogen-Regulated Theanine and Flavonoid Biosynthesis in Tea Plant Roots: Protein-Level Regulation Revealed by Multiomics Analyses”的研究成果，通过TMT蛋白质组学和泛素化蛋白质组学研究方法，发现了氮缺乏条件下茶树根部响应的差异表达蛋白和泛素化蛋白质，为茶氨酸和黄酮类生物合成的调控提供了新的见解，为茶树翻译后修饰调控次生代谢的研究提供了理论依据。

茶树（Camellia sinensis L.）因其独特的风味和健康益处而成为世界上受欢迎的饮料作物之一。茶叶冲泡的质量和健康益处是由丰富的次生代谢产物赋予的，例如茶叶中富含的黄酮类化合物、茶氨酸和咖啡因。茶氨酸是茶树中独特的非蛋白质氨基酸，一般占茶叶干重的1-2%，茶叶中游离氨基酸高达40-70%。茶氨酸含量与茶品质呈高度正相关。大量研究表明，茶氨酸具有许多健康作用，包括降低焦虑、降低血压、控制高血压、抑制肿瘤生长。

本文先前的研究中，作者探索了茶树中不同水平和形式的氮在转录水平上对氨基酸代谢的调节[1]。目前尚不清楚氮如何在茶树根部的蛋白质水平上调节茶氨酸和黄酮类代谢。泛素化是一种重要的翻译后修饰，主要通过靶向降解蛋白质来调节植物的生长、发育和适应胁迫。最近的研究结果揭示了泛素化参与植物对氨基酸和黄酮类代谢的适应[2,3]。然而，泛素化如何参与茶树根部的氨基酸和黄酮类代谢尚待发现。

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1. 缺乏氮会降低茶树根部的茶氨酸积累并增加黄酮类化合物的积累

选择大小相似的水培茶苗进行缺氮（0 N）和正常氮处理（CK）。处理后10天收集发育良好的根以进行进一步分析（图2a）。为了验证缺N处理对茶树幼苗的影响，作者首先检查了之前研究中鉴定的N缺乏响应基因的表达，包括CsNRT1.2、CsNRT1.5、CsAMT3.1和CsLBD38，结果表明与CK相比，CsNRT1.2和CsAMT3.1在0N下显著上调，CsNRT1.5和CsLBD38明显下调（图2b）。此外，还观察到在0 N处理下根系发育增加。这些结果表明N缺乏处理是有效的。

作者接下来测量了根中EA、游离氨基酸和类黄酮的含量。这些游离氨基酸的含量在缺氮处理下持续且显著降低（表1）。值得注意的是，在茶氨酸合成通路中，Thea、Glu和Gln在0 N下显著减少（图2c）。Thea生物合成的另一种前体EA的含量也显著下降。相反，类黄酮的积累在0 N下增加（图2 d-f）。这些结果表明，N缺乏抑制了茶树根部的茶氨酸代谢并促进了黄酮类代谢。

表1 | 缺氮时游离氨基酸的含量

图2 | 缺氮对茶树根系生长发育的影响

2.黄酮类和氨基酸代谢通路是根部缺氮的核心反应

为了探索氮如何调节茶树根部的茶氨酸和黄酮类代谢，作者在CK和0 N条件下对根部进行了TMT蛋白质组学分析。结果共鉴定出6612种蛋白质。与之前转录组数据中相比，有97.6%的蛋白包含在转录组数据中（图3a）。统计分析发现545个差异蛋白（DEP），包括239个上调蛋白和306个下调蛋白（图3b）。KEGG分析表明，上调的蛋白质在“次级代谢产物的生物合成”、“苯丙烷生物合成”、“类黄酮生物合成”和“苯丙氨酸代谢”中显著富集（图3c）。下调的蛋白质富含“核糖体”、“苯丙烷生物合成”、“光合生物中的碳固定”和“光合作用”（图3d）。这些结果表明，N缺乏显著改变了茶树根部苯丙烷和黄酮代谢通路中的蛋白质水平。

然后，作者将这些DEP与之前研究中鉴定的差异表达基因(DEG)进行比较（图3e），结果表明超过一半的DEP在转录水平上对0 N没有显著反应。说明茶树根部存在响应于0 N的转录后或翻译后调节。KEGG分析表明，100个共同上调的基因显著富集于苯丙烷和类黄酮代谢，150个共同下调的基因显著富集于氮、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（图3f-g）。为了验证这些结果，通过qRT-PCR检查了编码CsGS、CsAlaDC、CsGDH2、CsPALs、CsCHS1、CsDFR、CsFLS和CsANS的九个基因的表达。qRT-PCR结果与转录组数据高度一致，证实了数据集的可靠性。

图3 | 差异表达蛋白（DEPs）和差异表达基因（DEGs）的比较分析

3.茶树根中泛素化蛋白的鉴定

泛素化是一种经典的翻译后修饰，主要通过靶向降解蛋白质来调节植物生长和发育。为了进一步探索根中氮调节的茶氨酸和黄酮类生物合成，作者通过泛素化蛋白组学分析鉴定了茶树根中的泛素化蛋白质。结果共鉴定了2264种蛋白质上的4869个赖氨酸泛素化(Kub)位点。为了了解Kub位点周围氨基酸的特性，使用iceLogo分析了赖氨酸残基泛素化的频率。结果观察到对泛素化Lys附近的亲水残基的偏好，包括Asp(D)、Glu(E)和Arg(R)（图4c）。在4789个Kub肽中，鉴定了16个保守基序（图4a）。16个Kub基序表现出不同的丰度，其中.......EK.......基序的分布最为广泛（图4b）。为了深入了解泛素化蛋白质的功能，进行了KEGG富集分析。泛素化蛋白在谷胱甘肽代谢、内吞作用、糖酵解、泛素介导的蛋白水解、萜类醌生物合成、磷酸戊糖通路和苯丙氨酸代谢中显著富集（图4d）。亚细胞定位结果表明泛素化蛋白主要分布在细胞核、细胞质、质体和质膜中（图4e）。

图4 | 茶树根系泛素化蛋白序列特征

4. 整合转录组学、蛋白质组学和泛素化蛋白组学分析鉴定了蛋白质缺氮的不同反应模式

为了进一步阐明类黄酮和茶氨酸代谢在多水平上的调节，作者对转录组、蛋白质组和泛素组数据进行了整合分析。如图5a所示，在2264个泛素化蛋白质中，有1601个与蛋白质组鉴定结果重叠，2231个蛋白质与转录组鉴定的基因重叠。在三个数据集中共同鉴定了1585个基因/蛋白质。接着作者将泛素化蛋白与上调和下调的DEP和DEG进行了比较。这些比较鉴定了对0 N的不同反应模式，如图5B和C所示。例如，55种蛋白质在mRNA水平和蛋白质水平上调并且也被泛素化（图5b），30种蛋白质在mRNA水平和蛋白质水平下调，并且也被泛素化（图5c）。

代谢物积累是许多过程综合作用的结果，包括生物合成、运输和降解。这些过程通常受激素介导的信号传导、表观遗传修饰介导的转录和转录后调控以及翻译后修饰的调控。因此，作者接下来尝试鉴定参与氨基酸和黄酮类化合物的代谢、运输、激素调节、转录调节、表观遗传调节和泛素介导调节的蛋白质。发现除了许多结构基因和转运蛋白外，MYB和LBD转录因子、组蛋白、组蛋白去乙酰化酶、DNA甲基转移酶、E2泛素结合酶和E3泛素蛋白连接酶也对0 N有反应，其中一些也同样是泛素化蛋白，表明这些蛋白质在茶树根部的茶氨酸和黄酮类代谢中具有潜在的调节作用。

图5 | DEGs、DEPs和泛素化蛋白的比较分析

5.蛋白质水平调节茶氨酸代谢以响应根部缺氮

为了探索茶树根部茶氨酸代谢的蛋白质水平调控，作者分析了茶氨酸生物合成、氮吸收和氮同化通路中的DEGs和泛素化蛋白质。Glu和EA是茶氨酸生物合成的前体。作者发现Glu和Thea生物合成中的蛋白质在0 N通常下调（图6）。丙氨酸(Ala)通过丙氨酸氨基转移酶(CsAlaT)从丙酮酸合成，然后通过丙氨酸脱羧酶(CsAlaDC)代谢成EA（图6）。CsAlaT和CsAlaDC在mRNA(CsAlaT)或蛋白质(CsAlaDC)水平都下调，并且都在0 N下泛素化。这些结果表明CsAlaT和CsAlaDC从丙酮酸合成EA在茶氨酸生物合成中起着重要的调节作用（图6）。

Glu不仅是茶氨酸生物合成的前体，也是N代谢最重要的初级代谢产物之一。因此，Glu合成受到严格控制。Glu可以通过GS/GOGAT循环或通过茶树中的谷氨酸脱氢酶(GDH)合成。值得注意的是，一个CsGS、两个CsGOGAT和一个CsGDH在蛋白质水平下调，并且CsGS在0 N中也被泛素化（图6）。有趣的是，茶氨酸合成酶(CsTSI)，即从Glu和EA合成茶氨酸的酶，在RNA或蛋白质水平上都没有显著变化，但它可以被泛素化。因此泛素化可能在调节CsTSI活性中起作用。

图6 | 参与茶氨酸和谷氨酸代谢的DEGs和DEPs

6. 苯丙烷和类黄酮代谢的蛋白质水平调节以响应根部缺氮

为了揭示茶植物根中类黄酮代谢的蛋白质水平调节，作者重点研究了苯丙烷和类黄酮代谢通路中的DEPs及泛素化蛋白质（图7）。从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)到苯丙氨酸(Phe)的代谢通路中，DHQ/SDH在转录和蛋白质水平上均下调，并且也被泛素化。在苯丙烷通路中，苯丙氨酸解氨酶(CsPALs)在转录和蛋白质水平上均上调，并且在0 N下也泛素化。在木质素代谢通路中，CsHCTs和CsCAD的转录和蛋白质水平在N缺乏下显著增加，并且它们被泛素化修饰。有趣的是，CsCHS在转录水平上没有显著变化，但在蛋白质水平上显著增加并被泛素化。此外，黄酮醇合酶(CsFLS)、二氢黄酮醇还原酶(CsDFR)、花色素合酶(CsANS)和花色素还原酶(CsANR)在蛋白质水平上均显著增加并被泛素化。这些结果表明这些蛋白质的稳定性在N缺乏下增加，然后促进黄酮类代谢物的合成。

图7 | DEGs和DEPs参与苯丙烷和类黄酮代谢

该研究揭示了茶树根部中N对茶氨酸和黄酮类生物合成的多级调节（图8）。在N供应下，茶氨酸生物合成得到促进，类黄酮代谢受到抑制。N缺乏时，与茶氨酸合成相关的结构基因在mRNA和/或蛋白质水平下调；相比之下，类黄酮生物合成通路中的大量基因在mRNA和/或蛋白质水平上显著上调。在茶氨酸和类黄酮代谢的协调中，泛素化可能参与调节结构蛋白的稳定性或活性。

图8 | 茶树根中氮调节的茶氨酸(Thea)和原花青素(PA)代谢模型

茶氨酸和黄酮类化合物是茶树根部合成的最重要和最丰富的次生代谢产物。氮在茶树根部促进茶氨酸并抑制黄酮类生物合成，但其潜在机制仍不清楚。本文分析了氮缺乏下茶树根部的茶氨酸和黄酮类代谢，通过蛋白质组和泛素化蛋白质组结合转录组数据探索了调节机制。本文的多组学数据整合分析思路值得借鉴。

文献参考：

[1] Yang, T.; Li, H.; Tai, Y.; Dong, C.; Cheng, X.; Xia, E.; Chen, Z.; Li, F.; Wan, X.; Zhang, Z. Transcriptional regulation of amino acid metabolism in response to nitrogen deficiency and nitrogen forms in tea plant root (Camellia sinensis L.). Sci. Rep. 2020, 10, 6868.

[2] Lin, W.; Huang, T.; Chiou, T. Nitrogen limitation adaptation, a target of microRNA827, mediates degradation of plasma membranelocalized phosphate transporters to maintain phosphate homeostasis in Arabidopsis. Plant Cell 2013, 25, 4061−4074.

[3] Zhang, X.; Abrahan, C.; Colquhoun, T.; Liu, C. A proteolytic regulator controlling chalcone synthase stability and flavonoid biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell 2017, 29, 1157−1174.

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云起 撰文

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