项目文章 | 定量蛋白组学解析骨髓间充质干细胞外泌体对帕金森小鼠模型的治疗潜力

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2021年8月，中国医学科学院基础医学研究所赵春华和韩钦课题组在Aging and disease期刊发表了题为“MSC-derived Exosomes can Enhance the Angiogenesis of Human Brain MECs and show Therapeutic Potential in a Mouse Model of Parkinson''s Disease”的研究成果，通过蛋白质组学研究方法，发现了间充质干细胞衍生的外泌体可以通过增加ICAM1的表达来促人脑MECs血管生成，并减轻MPP+对细胞的损伤，提供骨髓间充质干细胞衍生外泌体治疗帕金森的可能性。

帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病，以震颤和延迟运动为特征。潜在的病理特征包括黑质和纹状体多巴胺通路的进行性退化、神经元丢失和多巴胺(DA)耗竭。神经元和血管细胞构成了神经血管单元(NVU)，可以分泌生长因子和粘附分子，不仅调节神经元的存活，还能维持血管稳态和增强血管生成。因此，研究表明，血管内皮生长因子可能介导血管生成并提高神经元存活率。基于这些发现，作者想研究特异性诱导NVUs的改善是否能促进PD的恢复，为PD的治疗提供一种有效的可能治疗机制。

临床试验表明，干细胞修复或替代是帕金森病有效的治疗方法。所以，迫切需要找到创新的治疗方法来替代受损的神经元。间充质基质细胞是一种多功能细胞，为帕金森病等多种神经疾病的治疗提供了巨大的希望。它们的再生作用被认为主要依赖于生长因子和外泌体的分泌，或可减少神经炎症。越来越多的证据表明，细胞外囊泡通过释放蛋白质、脂质和核酸在细胞间起着关键作用。其中干细胞的外泌体不仅调节正常的生理过程，如组织修复和免疫监控，还促进病理过程，如肾损伤和自身免疫性结缔组织疾病。本研究的目的是评估来源于骨髓间充质干细胞的外泌体是否有助于血管生成，进而促进帕金森的恢复。

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1.间充质干细胞衍生的外泌体的制备(M-Exos)

由骨髓间充质干细胞分泌的外泌体的直径通过透射电镜进行评估，发现范围为30至200nm(图1A)。此外，蛋白质印迹分析被用于确认外泌体特异性蛋白标记CD63、HSP70和HSP90的存在(图1B)。最后，NTA分析证实了透射电镜显示的近似尺寸范围，直径范围从30nm到100nm(图1C)。为了证实它们的生物活性，将DiL标记的外泌体加入到HBMECs培养物中，0、6和12小时后的实时荧光显微镜显示HBMECs吸收了大量的外泌体(图1D)。

图1 | 来自间质干细胞衍生的外泌体（M-EXOS）的表征和摄取

2.M-Exos治疗HBMECs蛋白质组学分析

通过蛋白质组学分析检测了经M-Exos处理的HBMECs的改变。外泌体激活了HBMECs，在0、24和48小时各种基因的表达增加(图2A)。此外，热图分析揭示了不同表达的功能基因，包括与炎症、细胞增殖、免疫调节和血管生成相关的因素(图2B-E)。时序分析表明，HBMECs中标记基因的上调与炎症因子IL3RA有关，增殖相关蛋白CD40和免疫调节因子TNFRSF10C(图2F-H)。作者主要研究外泌体是否促进人脑微血管内皮细胞的血管生成能力，因此初步验证了M-Exos治疗后血管生成相关基因的表达。蛋白质印迹结果显示血管生成相关基因FlK1和ANGPT1的表达明显增强(图2I)。综上所述，结果证实了M-Exos诱导了人脑微血管内皮细胞的功能改变。

图2 | 不同时间点M-Exos处理的HBMECs的蛋白质组学分析

3.M-Exos通过增加ICAM1的表达来调节HBMECs的血管生成

为了进一步研究M-Exos对体内血管生成的影响，作者将ECM凝胶和HBMECs的混合物皮下注射，用或没有100μg/ml外来物进入小鼠的右前肢。在8天后收集皮下组织，然后进行CD31的免疫组织化学染色，其是内皮细胞的标志物。结果表明，具有外出刺激的HBMECs比没有刺激的控制HBMEC产生更多的管状结构（图3A/B）。

此外，免疫染色显示，血管生成基因Angpt1和Flk1表达也增加（图3C/D）。接下来，作者评估了ICAM1蛋白的分泌，其在血管生成中可能发挥关键作用，并通过蛋白质组学和时间序列分析在血管生成中发挥着关键作用（图3E）。时间序列分析表明，外出刺激后ICAM1表达增加（图3F）。此外，当ICAM1在HBMECs中时，血管形成容量显著降低（图3I/j）。这些结果表明M-Exos通过增加HBMECs中的ICAM1的表达来调节血管生成。

图3 | 外泌体处理后，HBMECs的ICAM1表达上调

为了进一步验证帕金森病动物模型中血管生成增强的可能机制，作者使用1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)建立了小鼠帕金森病相关细胞损伤模型。作者首先检测了在不同时间点M-Exos处理的HBMECs中ICAM1的表达，结果显示ICAM1的表达通过外泌体刺激以时间依赖的方式增加(图4A)。

然而，当用不同浓度的MPP+预处理HBMECs 48h时，ICAM1的量明显减少(图4B)。值得注意的是，通过用100µg/ml的M-Exos刺激，ICAM1的表达得以恢复(图4C)。总的来说，这些结果表明来源于骨髓间充质干细胞的外泌体可以通过增加ICAM1的表达来促进骨髓间充质干细胞的成管，并在MPP+治疗后恢复ICAM1的表达。

图4 | 1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)影响H

4.M-Exos通过SMAD3和p38 MAPK信号通路促进血管生成

为了确定哪些信号通路被M-Exos激活，作者在用M-Exos处理48 h或用载体模拟处理的HBMECs中筛选了几种信号通路。KEGG分析揭示了AMPK、p38MAPK、VEGF、PPAR、EGF和PD相关信号通路的参与，如图5A和b所示。作者接下来使用蛋白质印迹分析证实了M-Exos刺激后HBMECs中SMAD3和p38 MAPK信号通路的强烈和快速激活。此外，在敲除HBMECs中的ICAM1后，这两种信号通路中因子的磷酸化显著降低(图5C)。此外，ICAM1的敲除明显减弱了血管生成相关基因VEGF和FLK1的表达(图5D)。因此，结果表明外泌体通过激活SMAD3和p38 MAPK信号通路来促进HBMECs的血管生成。

图5 | M-Exos激活了HBMECs中的SMAD3和p38 MAPK信号通路

5.M-Exos通过ICAM1介导的体内血管生成促进帕金森的恢复

为了构建帕金森病小鼠模型，给动物腹腔注射PBS、MPTP或MPTP+外泌体，每组10只小鼠。当将标记的外泌体腹膜内注射到小鼠体内时，它们在MPTP治疗后表现出聚集到受伤部位，包括大脑和四肢(图6A)。蛋白质组学分析发现的差异表达蛋白与多种神经退行性疾病相关，包括帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病(图6B)。

此外，高效液相色谱分析显示，与PBS和MPTP处理组相比，MPTP+外泌体组的小鼠纹状体中DA的量增加(图6C)。为了进一步验证外泌体对体内PD恢复的影响，作者进行了免疫荧光染色以检测表达α-SYN和TH的细胞。如图6D所示，与PBS组相比，MPTP治疗后α-SYN的表达显著增加。此外，M-Exos显然逆转了MPTP的影响。此外，作者观察到在黑质区域出现TH表达阳性细胞，这表明在MPTP治疗的5周期间TH表达阳性细胞的丰度降低，而腹腔注射M-Exos可以有效地逆转这种效应(图6E)。综上所述，结果表明M-Exos能促进PD模型小鼠体内的恢复。

图6 | 外泌体有助于帕金森病模型小鼠体内的恢复

据报道，在帕金森病动物模型中，血脑屏障的通透性增加，血脑屏障功能障碍也可能与血管生成有关。免疫荧光染色显示，与MPTP组相比，共注射MPTP和M-Exos的小鼠纹状体和黑质中ICAM1的表达明显改善(图7A)。接下来，作者检测了血管生成标记基因CD31的表达。免疫荧光染色结果表明，与单独MPTP治疗相比，加入M-Exos后，纹状体区域CD31的表达明显增强(图7B)。因此，M-Exos可以通过增加小鼠帕金森病模型中ICAM1的表达来促进血管生成，对人类帕金森病可能有治疗意义。

图7 | CAM1的表达在体内血管生成过程中起着重要作用

源自MSCs的外泌体可以通过增加ICAM1的表达来促进HBMECs的血管生成，并减轻1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）对这些细胞造成的损伤。研究表明，当ICAM1被敲除时，HBMECs的血管形成能力明显降低。此外，发现ICAM1通过激活SMAD3和P38MAPK信号通路促进HBMECs的血管生成。在PD小鼠模型中，发现MSC衍生的外泌体通过促进ICAM1相关的血管生成来促进PD的恢复。这些发现表明外泌体-ICAM1-SMAD3/P38MAPK轴可以促进HBMECs的血管生成，可能具有治疗PD的潜力。

本研究运用蛋白质组学，蛋白质印迹，免疫荧光、免疫组化等分析了源自MSCs的外泌体可以使人脑微血管内皮细胞(HBMECs)保持活跃状态，有利于血管生成。应用PD小鼠模型发现MSCs的外泌体可以促进PD的恢复。结果可以为MSCs衍生的外泌体在PD治疗方面提供可能性。

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房角石 撰文

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