项目文章 | 上海肿瘤研究所甘愉/屠红团队发现预防胰腺癌细胞转移新机制

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● 前言



2021年3月,上海交通大学医学院附属仁济医院上海肿瘤研究所甘愉博士、屠红博士课题组在Frontiers in Oncology期刊发表了题为 “E3 Ubiquitin Ligase UBR5 Promotes the Metastasis of Pancreatic Cancervia Destabilizing F-Actin CappingProtein CAPZA1”的研究成果,通过蛋白鉴定+组织微阵列+免疫组织化学+免疫荧光共焦成像+蛋白印迹研究方法,发现了作为胰腺癌转移的新的和关键的调节因子,为预防胰腺癌患者转移的治疗靶点提供了理论依据。



中文标题:E3泛素连接酶UBR5通过破坏稳定的F-肌动蛋白封闭蛋白CAPZA1促进胰腺癌转移

研究方向:胰腺癌

发表期刊:Frontiers in Oncology

影响因子:6.244

发表时间:2021年3月

发表单位:上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室

运用生物技术:蛋白鉴定(由鹿明生物提供技术支持)+组织微阵列+免疫组织化学+免疫荧光共焦成像+蛋白印迹


● 研究背景



胰腺癌是癌症死亡的第四大原因,胰腺癌患者的平均生存期仅为诊断后6-9个月。更重要的是,当癌症扩散到远处时,胰腺癌患者通常被诊断为晚期。据估计,大约80-85%的胰腺癌患者因转移而死亡。因此,阐明胰腺癌转移的机制迫在眉睫。


泛素-蛋白酶体系统(UPS)是真核生物细胞内蛋白质降解和更新的主要翻译后机制。在各种病理状态下都观察到UPS功能异常。近年来,UPS在癌症转移中的作用越来越受到关注。


蛋白质泛素化是一个多步骤过程,分别由泛素激活酶(E1s)、泛素结合酶(E2s)和泛素连接酶(E3s)介导。有研究表明E2泛素结合酶UbcH10或UBE2Q1作为致癌基因发挥促进结直肠癌或肝细胞癌转移的作用。这些发现表明UPS在癌症转移中的重要性。UBR5是E3连接酶之一,在UPS酶促级联反应中占据关键位置,因为它们在很大程度上决定了要泛素化的蛋白质底物的特异性。


研究技术路线



(点击大图查看详细研究策略)


● 研究结果



1.UBR5在胰腺癌中上调并与不良预后相关

基于来自癌症基因组图谱(TCGA)和基因型-组织表达(GTEx)数据库的RNA-seq数据,以及来自GEO数据库的基于微阵列的基因表达谱(GSE16515和GSE15471),发现与非癌胰腺组织相比,UBR5mRNA在胰腺癌组织中的表达显著增加(图1A,B)。用组织芯片免疫组织化学染色平行检测UBR5的蛋白表达。与邻近的非癌组织相比,胰腺癌组织中UBR5的蛋白水平一直显著升高(图1C、D)然后,作者根据UBR5的表达将来自TMA队列和TCGA的胰腺癌患者分为低表达组和高表达组,并分析临床病理特征与UBR5表达水平之间的相关性。


UBR5与淋巴结转移显著相关,并倾向于与病理肿瘤分期相关。此外,在线生存分析显示,与UBR5表达较低的患者相比,UBR5表达较高的患者总生存期(HR=1.71(1.14–2.58),P=0.0091)和无复发生存期(HR=3.6(1.5–8.63),P=0.0022)显著缩短(图1E)总的来说,这些数据表明UBR5在胰腺癌中的重要作用。

图1 | UBR5在胰腺癌中上调,并与不良预后相关


2.UBR5促进胰腺癌的体外迁移和侵袭

与UBR5在胰腺癌组织中上调的观察结果一致,五种胰腺癌细胞系(AsPC-1、BxPC-3、CFPAC-1、MIA PaCa-2和PANC1)在mRNA和蛋白质水平上都显示出明显高于正常人胰管上皮hTERT-HPNE细胞的UBR5表达(图2A,B)。为了研究其功能作用,作者通过慢病毒介导的shRNAs在CFPAC1和PANC-1细胞中敲除了内源性UBR5(图2C),后者呈现UBR5的相对高表达(图2A,B)。伤口愈合试验和基于基质凝胶的跨孔侵入分析表明,UBR5敲除导致体外CFPAC-1和PANC-1细胞的迁移和侵入都显著减少(图2D,E)。相反,在MIA PaCa-2和BxPC-3细胞中UBR5的过表达(图2F)显著增强了它们在体外的迁移和侵袭能力(图2G,H),这两种细胞在五种测试的胰腺癌细胞系中UBR5的内在表达相对较低(图2A,B)表明UBR5能促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭。

图2 | UBR5在体外促进胰腺癌的迁移和侵袭


3.UBR5与CAPZA1相互作用并破坏其稳定性

为了鉴定潜在的UBR5结合蛋白,作者使用抗GFP抗体在转染了载体对照或GFP标记的UBR5质粒的HEK-293T细胞中进行了共免疫沉淀分析。然后对总免疫沉淀物(图3A)进行蛋白鉴定质谱分析。基于以下2个标准来选择用于UBR5的潜在相互作用蛋白质,结果鉴定出30种潜在的相互作用蛋白,其中超过四分之一与肌动蛋白细胞骨架组织有关,F-肌动蛋白亚单位α-1(CAPZA1)与癌细胞的迁移和侵袭能力有关。因此,作者聚焦于CAPZA1,探讨UBR5诱导的胰腺癌细胞迁移和侵袭增强的机制。


使用Co-IP分析,不仅在HEK293T细胞中,而且在用绿色荧光蛋白标记的UBR5转染的胰腺癌MIA PaCa-2和BxPC-3细胞中证实了UBR5与CAPZA1的相互作用(图3B)。然而,在不表达GFPUBR5融合蛋白的对照细胞中,在抗GFP抗体下拉的免疫沉淀物中不能检测到CAPZA1蛋白。此外,共聚焦显微镜显示UBR5和CAPZA1在胰腺癌细胞中的共同定位(图3C),进一步支持这两种蛋白质之间的相互作用。


接下来作者研究了UBR5对胰腺癌细胞中CAPZA1表达的影响。尽管UBR5的敲除或过表达对CAPZA1的mRNA水平没有影响(图3D),但其蛋白水平受到UBR5的负调节(图3E,F)。特异性抑制剂MG132对蛋白酶体的抑制很大程度上逆转了UBR5过表达诱导的CAPZA1的下调(图3G)。作者还在正常人胰腺导管上皮hTERT-HPNE细胞中过表达UBR5。尽管UBR5的过度表达显著下调了CAPZA1在hTERT-HPNE细胞中的表达,但未能促进其体外迁移和侵入能力。同时,在MG132存在的情况下,在表达MIA PaCa-2的ubl5中观察到泛素化CAPZA1的积累(图3H)。相反,泛素化的CAPZA1在UBR5敲除的CFPAC-1细胞中减少(图3H)这些结果表明UBR5通过胰腺癌细胞中的泛素-蛋白酶体途径使CAPZA1蛋白不稳定。

图3 | UBR5与CAPZA1相互作用并破坏其稳定性


4.UBR5通过CAPZA1介导的F-肌动蛋白重塑促进胰腺癌的迁移和侵袭

基于上述发现,作者接下来研究了CAPZA1在胰腺癌细胞中的作用。鉴于CAPZA1在UBR5敲除细胞中显著上调(图3E),作者在这些细胞中通过siRNAs下调CAPZA1(图4A,B)如图4C、D补充图4所示,UBR5敲除诱导的细胞迁移和侵袭抑制可被CFPAC1和PANC-1细胞中的siCAPZA1大大逆转。CAPZA1水平的降低可诱导肌动蛋白丝(F-actin)的积累,促进其动态重塑,为细胞侵袭和迁移提供动力。正如预期的那样,在转染了UBR5质粒的胰腺癌细胞中观察到了F-肌动蛋白强度的增加(图4E)。此外,作者对UBR5-knockdown CFPAC-1细胞中的F-肌动蛋白进行了免疫荧光染色。与对照细胞相比,UBR5-knockdown细胞中的肌动蛋白水平显著降低。还显示F-肌动蛋白的形成受到UBR5缺乏的抑制(图4F)这表明UBR5通过促进CAPZA1降解诱导的胰腺癌细胞F-肌动蛋白重塑来增强胰腺癌的迁移和侵袭。

图4 | UBR5通过CAPZA1介导的F-肌动蛋白重塑促进胰腺癌的迁移和侵袭


5.UBR5缺乏减少体内胰腺癌转移

为了进一步评估UBR5在体内的作用,将感染shUBR5的CFPAC1细胞注射到裸鼠的脾脏中以建立肝转移模型。六周后,处死这些裸鼠,测量肝脏中的微小肝癌病变。发现与用对照细胞处理的小鼠相比,注射了用shUBR5感染的CFPAC-1细胞的小鼠的肝脏被较少的微小肝癌病变覆盖(图5A)。作者计算了肝内转移瘤的数量和最大肝内转移瘤的直径,观察到UBR5敲除导致小鼠肝转移结节的数量和大小显著减少(图5B,C)。肝脏转移结节通过组织病理学检查得到证实(图5D)。此外,作者对转移性肿瘤中的UBR5和CAPZA1进行了免疫组织化学分析。如图5E所示,UBR5的低水平与UBR5敲除肿瘤中CAPZA1水平的增加有关。这些体内数据与作者的体外发现一致,支持UBR5通过破坏稳定的CAPZA1在胰腺癌中的转移促进作用。

图5 | UBR5缺乏减少体内胰腺癌转移


研究结论



在这里,作者提出了E3泛素连接酶UBR5在胰腺癌中的功能作用,UBR5是UPS的重要调节因子,并提供了确凿的证据证明UBR5可以显著促进胰腺癌转移。关于机制,作者的研究确定CAPZA1是UBR5的新底物,并表明UBR5介导CAPZA1的泛素-蛋白酶体依赖性降解,进而通过促进F-肌动蛋白重塑促进胰腺癌转移。UBR5正在成为癌症发展和进展的关键角色。然而,它在胰腺癌中的作用很少被研究。最近的一项研究表明UBR5对胰腺癌细胞有促进生长的作用。在这里,作者将对其功能的理解扩展到了胰腺癌转移的调控。基于功能丧失和功能获得的研究,UBR5被证明有助于胰腺癌的转移。目前的研究提供了证据证明UBR5是胰腺癌的有效转移促进剂,并表明UBR5通过促进CAPZA1的泛素化和降解发挥其转移促进作用。因此,靶向UBR5或UBR5介导的CAPZA1泛素化将为胰腺癌患者,尤其是UBR5高表达的胰腺癌患者提供有希望的预防癌症转移的策略。


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泛素-蛋白酶体系统(UPS)是细胞内蛋白质降解和更新的调节机制,其功能障碍与包括癌症在内的多种疾病有关。UBR5是一种E3泛素连接酶,正在成为UPS中的重要调节剂。本研究通过功能丧失和功能获得研究、裸鼠胰腺癌肝转移模型、免疫共沉淀结合质谱分析等研究方法得到结论:UBR5在胰腺癌组织中显着上调。UBR5高表达与淋巴结转移增加和患者生存率低相关,这对预防胰腺癌患者的转移起到了关键依据。


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参考文献:

1.Adamska A,Domenichini A,Falasca M.Pancreatic ductal adenocarcinoma:current and evolving therapies.Int J Mol Sci.(2017)18:1338.doi:10.3390/ijms18071338.

2.Krempley BD,Yu KH.Preclinical models of pancreatic ductal adenocarcinoma.Chin Clin Oncol.(2017)6:25.doi:10.21037/cco.2017.06.15.


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Andrea 撰文

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