【颗粒攻略】利用Multisizer 4e库尔特计数器检测藻类培养中的细菌污染

混合营养型金藻奥杜藻（Ochromonas danica）与马尔汉棕鞭藻（Poterioochromonas malhamensis）于静置锥形瓶中培养，培养温度为20°C，光照强度为30 μmol光子·m⁻²·s⁻¹。奥杜藻（O. danica）与马尔汉棕鞭藻（P. malhamensis）的培养采用含可溶性有机碳源的培养基（见图1）。

所有待测细胞悬液均使用Multisizer库尔特计数器测定培养物的总细胞数。实验选用100 μm小孔管，因预期藻类细胞大小在3-15 μm之间，对应的细胞体积约为20-1000 μm³（见图2）。取50-500 μl细胞悬液，加入12 ml Isoton II电解液中。每个样品需对细胞悬液与Isoton II电解液的混合液取500 μl进行三次重复测量，将三次测量的平均值保存为“#AV”格式文件。为消除培养基中纤维、晶体等杂质颗粒产生的背景噪音，每个样品需额外进行一次空白测量——即使用同等体积的培养基替代细胞悬液进行测定。通过Multisizer分析软件，将空白测量结果从平均值文件中扣除（以校正数据）。

所有藻类培养物均通过Multisizer库尔特计数器检测是否存在细菌污染。

为研究Multisizer库尔特计数器使用100 μm小孔管时，对细菌特征粒径范围（<20 μm³）内颗粒的检测灵敏度，实验将马尔汉棕鞭藻培养物的等分样品，与不同浓度的热灭活细菌混合。添加的细菌浓度通过测定600 nm波长下的光密度（OD）确定：若测得OD600＞1，则需稀释细胞悬液，直至可测得OD600＜1。本实验所用细菌细胞悬液的初始计算密度为OD600=10。

藻类与细菌的混合悬液中，细菌细胞的光密度通过以下方式测定：制备一份对照悬液（用同等体积培养基替代藻类悬液），测定其光密度即可。通过Multisizer记录颗粒粒度分布；为作对比，同时对样品进行显微镜观察。为提高细菌的光学可检测性，将细胞悬液等分样品用核酸荧光染料（SYBR-Green）处理后，在荧光显微镜下（400倍放大）观察。

奥杜藻与马尔汉棕鞭藻的细胞形态呈球形至水滴形，二者细胞大小相近（见图2）。通过Multisizer分析软件测得的这两种藻类的体积尺寸分布图也高度相似（见图3）。

马尔汉棕鞭藻与奥杜藻的培养物均为无菌培养物，即仅含藻类、不含细菌的培养物。在所有实验设置中，Multisizer搭配100 μm小孔管均可用于检测细菌是否存在。

在指数生长期，<20 μm³体积范围或约3 μm细胞直径范围内出现高浓度颗粒，是细菌污染的特征性表现，尤其当该范围内的颗粒密度超过藻类群体（20-2000 μm³体积或3.5-20 μm细胞直径）的颗粒密度时（见图4）。相应地，在未受污染的马尔汉棕鞭藻与奥杜藻培养物中，<20 μm³范围内未出现明显峰值（见图3）。

在生长曲线的指数生长后期与稳定期，细菌污染的检测仅能有限开展，因为裂解的藻类细胞也会在<20 μm³范围内形成峰值。将马尔汉棕鞭藻培养物与热灭活细菌悬液混合后，分别通过Multisizer 库尔特计数器和荧光染色法检测细菌：在细菌密度为OD600=0.05和OD600=0.03的样品中，显微镜下未观察到细菌；但通过Multisizer库尔特计数器测量时，在这些浓度下已能检测到细菌峰值（见图5）。当细菌密度为OD600=2时，无论是通过Multisizer库尔特计数器（图5A）还是显微镜（图5B），均能清晰检测到细菌。

因此，使用Multisizer库尔特计数器做藻类的总细胞计数时，可在实验过程中同时监测培养物是否存在细菌污染，且该方法的灵敏度与显微镜检测方法相当。