生物探索 | 烷基胺类离子对试剂对siRNA分析的影响

早期的寡核苷酸LC-MS方法是通过使用高浓度的TEA和HFIP（浓度分别是：16mM TEA 和 400mM HFIP）以便于保留这些带负电荷的极性化合物。然而， 在当前新型HPLC色谱柱填料下，使用这些传统的色谱流动相体系并不能有效地最优化色谱分析的效果和电喷雾的电离效果。虽然多数的烷基胺类离子对都已经是在质谱中被优化过的，但是在这个应用中，我们发现使用TEA作为离子对能更优化正反链siRNA的色谱分离。

色谱柱：bioZen^® 2.6 µm Oligo

色谱柱尺寸：100 x 2.1 mm

色谱柱货号：00D-4790-AN

流动相：

A: 12.5 mM HFIP, 离子对试剂如下图所示 / 纯水

B: 12.5 mM HFIP, 离子对试剂如下图所示 / 甲醇

梯度条件：如下图所示

流速：0.3 毫升/分钟

进样量：2微升（1微升/分钟）

温度：55摄氏度

检测器：UV-Vis @ 260nm

样品：siRNA

图1所展示的是用TEA作为离子对试剂来分析21mer双链RNA的色谱图。即使在12.5mM HFIP的浓度下，使用相对较低浓度4mM TEA也能siRNA提供足够的保留能力，并且有比较好的正反链分离。虽然这个色谱图没有能达到基线分离，但是通过高分辨率的质谱也是可以获得高质量的分析数据来作为每条核酸链的表征分析。

N, N-二异丙基乙胺 (DIEA) 是另外一种比较常用的的烷基胺类离子对，它能有效提供寡核苷酸在色谱中的分离及提高寡核苷酸在质谱中的电离吸收。

然而，如图2所示，对于分析相同的21mer双链RNA，我们看到了一些反常的色谱图。虽然看起来被更早洗脱出来的杂质多了，但是同时也发现正反链的分离度也降低了。进一步利用质谱来做表征从而判定不同离子对的使用对分析结果的实际影响。更为疏水的烷基胺类离子对，如：N, N-二甲基环己胺 （DMCHA）和 己胺 （HA）在分析上带来相似的色谱结果。通过优化离子对试剂的浓度和梯度条件，我们发现用DMCHA的分析结果是不好的（图3），而这种奇怪的色谱结果在HA条件下更加明显（图4）。

值得注意的是，如果我们的目的是提高质谱的灵敏度，那么TEA的效果可能就没有其他更为疏水的烷基胺类离子对效果好。而且，烷基胺能表现出更多的疏水作用力，能分析出更多的杂质。如果没有使用质谱来帮助定性的话，我们无法判定那些杂峰是否确实是杂质/失效的序列或者是色谱条件下的干扰峰。

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