临床SCI研究福音：FFPE、微量样本等临床样本怎么研究？有这招就够啦

其实有一个成熟的技术已经可以为大家解决上面的问题。这个技术叫做PCT-DIA。 

PCT-DIA技术是一种针对特殊样本的蛋白质组学技术。

主要针对的样本为：微量细胞样本、微量新鲜组织、石蜡穿刺样本、活体穿刺样本、石蜡切片样本、甲醛固定切片等。

PCT技术可将微量的珍贵样品中的蛋白质释放出来，从而获得足够质谱检测的肽段量。不仅可以最大限度地减少样品的处理，而且可使样品损失最小化。

DIA技术无通量限制，可用于大规模样本的蛋白鉴定，且数据覆盖度高、重复性好、稳定性好。

将这两种技术强强结合，可实现针对石蜡样品、甲醛处理样本、冰冻切片、活检样本等特殊样本或者微量样本的蛋白组学分析，运用其通量高、稳定性强、速度快和精度高的特点，可解决特殊样本或者微量样品难以进行蛋白质组的技术难题。

图1 |  PCT-DIA技术蛋白质组实验流程

利用PCT-DIA鉴定的FFPE样本、微量细胞或者微量组织的蛋白鉴定数量可达到3000-6000个。

Rapid mass spectrometric conversion of tissue biopsy samples into permanent quantitative digital proteome maps

研究内容：

2015年发表在Nature Medicine（IF= 36.13），利用PCT-DIA技术对新鲜穿刺组织和微量细胞样本进行蛋白质组鉴定：（1）获得优质的蛋白质定性和定量数据；（2）大样本数量的新鲜穿刺组织获得蛋白质组数据，可进行分子分型。

High-throughput proteomic analysis of FFPE tissue samples facilitates tumor stratification

研究内容：

2019年发表在Molecular Oncology（IF=6.574），利用PCT-DIA技术对脱蜡后的FFPE和冰冻样本进行蛋白质组鉴定：（1）FFPE样本和冰冻样本蛋白质组表达模式相似；（2）1-15年FFPE样本中的蛋白质组表达模式稳定；（3）FFPE样本中获得的蛋白质可用来筛选潜在生物标志物。

Protein Classifier for Thyroid Nodules Learned from Rapidly Acquired Proteotypes

研究内容：

2020年发表在medRxiv上，利用PCT-DIA技术对大样本数量的FFPE样本和活检穿刺样本进行蛋白质组研究，筛选出甲状腺结节诊断的潜在生物标志物。

a.什么是PCT技术

PCT是一种针对特殊样品的蛋白质前处理技术，利用Barocycle仪器(高低压循环破碎仪)通过在超高压和环境压力之间程序性、周期性变换，使样品中蛋白质释放，促进并加速蛋白质酶解。PCT技术具有速度快、损失操作简便、保真度高等特点。

图2 | Barocycle仪器示意图

b.PCT技术的优势及应用

可处理样本：石蜡包埋样本、甲醛固定样本、临床活检样本、微量细胞样本、花粉/鱼苗等。

肽段得率高、获得量稳定：

106的U2OS细胞（n=10）可获得平均总肽段量为116ug，CV=4.9%；1mg小鼠肝脏组织（n=4）可获得平均总肽段量50ug，CV=7.9%；1mg人肾脏组织（n=12，正常组织 vs 肿瘤组织）可获得平均总肽段量50ug，CV=40.7%（人样本个体差异较大，且肿瘤组织之间获得的肽段量变异系数偏大，因此对于人体样本，建议扩大生物学重复）（图1a）。获得的总肽段量比传统方法高20%（图1b）。总肽段量满足质谱检测的需求。

操作步骤少：比传统样本处理方法减少近10个步骤，且可最多96个样本同时前处理，减少了样本前处理的误差。

操作误差小：PCT技术通过Barocycle仪器（高低压循环破碎仪）精确控制，有效地减少了人为操作误差。

图3 |  PCT辅助组织裂解和蛋白质酶解的肽段得量和效率

（a）PCT技术对U2OS细胞、小鼠肝脏组织和人肾脏组织通过组织裂解、蛋白质提取及酶解后获得的肽段量和变异系数图；（b）用小鼠肝组织比较PCT技术和传统方法的酶解效率。PCT技术比传统方法获得的肽段数量高10%-20%。

参考文献：

Rapid mass spectrometric conversion of tissue biopsy samples into permanent quantitative digital proteome maps. Nat Med. 2015 Apr;21(4):407-13.

a.什么是DIA质谱扫描技术

到目前为止，蛋白质组学分析主要采用数据依赖采集（data dependent acquisition，DDA）和数据非依赖采集（data independent acquisition，DIA）两种质谱扫描模式。

DDA选择一级质谱中相对高峰度离子进行高能碰撞碎裂，产生的碎片离子送入二级质谱检测（图2A）。因此DDA扫描方式获得的数据覆盖率低、重复性低、稳定性低。

DIA将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂及检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息(图2B)。因此DIA扫描方式获得的数据覆盖率高、重复性高、稳定性高。

图4 |  DDA与DIA质谱扫描原理图

（a）DDA质谱扫描原理为每个扫描周期内，只采集丰度最高的10-20个母离子信号及对应的子离子碎片信息，其余母离子信息及子离子信息丢失。（b）每个扫描周期内，将质量区间设置为多个区段窗口，每次采集窗口内所有母离子及对应的子离子信号。

图5 |  DIA比DDA扫描获得的数据更稳定、更准确

（c）DIA定量准确性、线性范围接近靶向定量技术MRM/PRM水平；（d）DDA：CV<10%的数据~25%，CV<20%的数据~59%；DIA：CV<10%的数据~69%，CV<20%的数据~90%.

参考文献：

Gillet, L. C. et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol. Cell. Proteom. 11, O111.016717 (2012)

图6 |  DIA与预分6个组份的iTRAQ鉴定到的蛋白质数量相近，且DIA能够定量到更多的低丰度蛋白质.

参考文献：

Trayambak Basak,Ajay Bhat,et al。In-depth comparative proteomic analysis of yeast proteome using iTRAQ and SWATH based MS. Mol. BioSyst., 2015,11, 2135

PCT技术为特殊样本/微量样本前处理技术，可与DIA、TMT和PRM技术联用：

1、样本数量>16个，采用PCT-DIA技术，需要利用混样建立DDA本地数据库。

2、样本数量≤16个，采用PCT-TMT技术，无需建立数据库，但有样本数量限制。

3、靶向蛋白验证，采用PCT-PRM技术，无需抗体，一次对一个样本中20-40个蛋白进行靶向验证。

通常利用PCT-DIA技术进行普筛，获得目标蛋白后，利用PCT-PRM技术进行目标蛋白验证。

猜你还想看

◆项目文章 | 酵母文库及蛋白质组学助力中科院遗传发育所喜登NC(IF:12.121)

◆看看专家们怎么做研究？2020质谱组学研讨会-肿瘤机制解析与分型诊断

◆恭喜 | 10月，欧易/鹿明生物蛋白/代谢方向13家合作课题组老师顺利发文

◆新品 | 2大尚方宝剑，双平台+双自建数据库助力医学代谢组学研究

END

貔貅 撰文

欢迎转发到朋友圈

本文系鹿明生物原创

转载请注明本文转自鹿明生物