超高速原子力+质量光度法研究粘连蛋白介导DNA环挤出过程

2026-01-12 10:09:08, 北京佰司特科技北京佰司特科技有限责任公司

/HS-AFM/

黏连蛋白（cohesin）是一种结合染色体的多亚基腺苷三磷酸酶复合物，可捕获姊妹染色单体进行染色体分离。有丝分裂期染色体异常分离是导致染色体不稳定性的重要原因，可能造成染色体数目的增加或减少，会导致基因表达异常及机体发育异常，并与肿瘤的发生和转移密切相关。先前的研究表明黏连蛋白和染色体结构维持SMC（Structural maintenance of chromosomes）蛋白复合物能够将DNA挤压，形成环状结构。但是这一过程的具体细节是如何进行的还不得而知。为此，来自奥地利维也纳生物中心 (VBC)分子病理学研究所Jan-Michael Peters研究组在《Cell》杂志上发表了《Cohesin mediates DNA loop extrusion by a ‘‘swing and clamp’’ mechanism》。

作者借助超高速视频原子力显微镜分析了人类粘连蛋白-NIPBL复合物如何介导DNA环挤出，并促使细胞中的染色质折叠。又通过单分子质量光度计证实了SMC1和SMC3头部结构域（SMC1HD、SMC3HD）可以各自结合单个DNA分子作为单体。

01 粘连蛋白-NIPBL复合物

目前，一些体外的生化重构实验一定程度上已经证实了环挤出假说，这些结果证明SMC蛋白与Cohesin蛋白会以2.1kb/s的速度挤压DNA，并且这一过程依赖于ATP酶活性。但限于实验分辨率等问题，环挤出的过程是如何实现的具体细节还不得而知。

作者借助超高速视频原子力显微镜（High-speed atomic force microscopy，HS-AFM）对Cohesin进行了实时成像。他们分析了人类粘连蛋白-NIPBL复合物如何介导环挤出，并使间期细胞中的染色质折叠。他们已经确定了环挤出所需的DNA结合位点和大规模构象变化，并确定了这些是如何协调的。他们的结果表明DNA通过自发的50nm摆动的粘连蛋白铰链转移，将DNA交给SMC3的ATPase头部，在那里结合ATP，然后DNA被NIPBL夹住。

在这个过程中，NIPBL从铰链“跳跃”到SMC3头部，从而可能将自发铰链摆动与ATP依赖性DNA夹紧结合起来。这些结果揭示了粘连蛋白-NIPBL和可能的其他染色体结构维持（SMC）复合物如何介导环挤出的机械原理。HS-AFM突破了传统原子力显微镜“扫描成像速慢”的限制，能够实现在液体环境下超快速动态成像，分辨率为纳米水平。待测样品无需特殊固定，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子的互作研究和动态观测。

02 内聚蛋白二聚体

作者发现DNA结合位点在易位中起作用，至少其中一些可以彼此相对移动运输DNA，并可能将DNA从一个位点“移交”到另一个位点。EM观察到的不同构象，但尚不清楚其中哪些存在于本地条件下以及内聚物是如何从一种构象变成另一个。因此，利用超高速视频原子力显微镜（HS-AFM）对粘连蛋白进行了实时成像。通过这种可视化技术确定哪些单元和域，铰链在三聚体中可以看到（hi）、卷曲线圈和头部结构域（he）含有SMC1, SMC3和SCC1的复合物，但SMC1和SMC3无法相互区分。

不能清晰观察到SCC1，可能是因为这个亚基被预测为部分非结构化，但质谱测定证实这些配合物含有SCC1。分离后出现STAG1（S）和NIPBL （N）作为球形颗粒和粘结剂三聚体，作为ASTP酶附近的额外密度，当STAG1和NIPBL同时出现时结合到三聚体的大小结构附近的SMC头增加，但在大多数复合体中SMC头、STAG1和NIPBL无法清晰区分。体积测量得到的数据与预测一致所有亚基和复合体的质量和指示NIPBL单独形成二聚体，但与内聚蛋白结合单体。

03 构想之间的变化

在ATP存在的情况下的，Cohesin三聚体复合物中会在环状、杆状以及弯曲状构象之间的变化。作者们发现DNA是通过Cohesin蛋白铰链的弯曲进而易位的，这样将DNA转移到SMC3的ATP酶活性头部，在该位置与ATP结合，DNA被NIPBL夹住。在此过程中NIPBL从铰链向SMC3头部移动，引发铰链区域的自发摆动以及ATP依赖的DNA结合，从而形成一个循环，使得DNA从铰链延伸到SMC3的头部，在此循环周期的末尾，DNA片段可以转移到SMC1的头部。由此，作者们提出了DNA环挤出的“摆-夹”“Swing and clamp”模型，这类似于抓娃娃机的小爪子，可以将通过铰链的弯曲伸出机械手“抓住”DNA，然后上提，从而通过一次次循环促使DNA逐步环挤出。

三聚体环在接合和不接合之间振荡在后一种构象中，可以对齐和弯曲它们的线圈。相似的变化当STAG1和NIPBL与三聚体结合时可见。将盘绕的线圈折叠成弯曲状态发生不对称，铰链到达靠近一个头部而不是另一个头部。在一些建筑群中，只有一个线圈是弯曲的，也导致铰链和一个头之间的接近，可能反映的情况是用吸附法固定化了一个线圈云母表面用于成像。帧测量两个头和铰链之间的距离证实了弯曲不对称，在trimer-NIPBL，在80%的弯曲构象中显示铰链靠近nipbl绑定的头部。这些分析也证实了铰链弯曲只有在没有人头和副牙的情况下才会发生相反，说明两个构象变化是互斥。

随后，作者又通过单分子质量光度计证实了SMC1和SMC3头部结构域（SMC1HD、SMC3HD）可以各自结合单个DNA分子作为单体：在存在ATP的前提下，对SMC1HD和SMC3HD含和不含40碱基对（bp）双链（ds）DNA进行质量光度分析，负质量对应于蛋白质-DNA复合物在两帧之间从表面解离的事件。

04 超高速视频级原子力显微镜

超高速视频级原子力显微镜（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大学 Prof. Ando 教授团队研发，日本RIBM公司商业化的产品，可以达到视频级成像的商业化原子力显微镜。HS-AFM突破了传统原子力显微镜“扫描成像速慢”的限制，能够在液体环境下超快速动态成像，分辨率为纳米水平。样品无需特殊固定，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。超高速视频级原子力显微镜HS-AFM主要有两种型号，SS-NEX样品扫描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探针扫描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今，全球已有150多位用户，发表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等顶级杂志。

HS-AFM有 4 种扫描台可供选择，适用于不同的样本，包括蛋白质，DNA，细菌，细胞等。样品无需特殊固定染色，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。液体环境下直接检测，超快速动态成像，分辨率为纳米水平。探针小，适用于生物样品；悬臂探针共振频率高，弹簧系数小，避免了对生物样品等的损伤。悬臂探针可自动漂移校准，适用于长时间观测。采用动态PID控制，高速扫描时仍可获得清晰的图像。XY轴分辨率2nm；Z轴分辨率0.5nm。

HS-AFM采用了新的高频微悬臂架构，更低噪音、更高稳定性的控制器，高速扫描器，缓冲防震设计，主动阻尼，动态PID，驱动算法优化，多种前沿技术，可以实现在超高速下获取高分辨的生物样品信息。新系统整合了基于工作流程的操作软件，直观的用户界面与流程化、自动化的设置使得研究人员可以专注于实验设计，不需要复杂的操作和条件设置，快速获取数据，加速研究的产出。HS-AFM为科研工作者了解生物物理、生物化学、分子生物学、病毒学以及生物医学等领域的单分子动态过程提供了一款强大的工具。

05 单分子质量光度计

单分子质量光度计，是基于质量光度学研发的一款设备，建立在干涉反射显微镜和干涉散射显微镜的原理之上。牛津大学的Kukura教授团队证明了单分子在观察界面上散射的微小光量能够被可靠地检测到，可以用于计算溶液中的分子数量，更重要的是，它与分子质量直接相关，可以用于测量分子的质量。

样品底部照射激光束并预先聚焦载玻片的上表面，您将观察到来自载玻片的反射光。如果样品（蛋白质分子等）与载玻片接触，则折射率只会在该部分发生局部变化，并且来自被测物体的散射光也会被检测到。附着在载玻片上的分子散射的光干扰了该界面反射的光。样品在载玻片上散射光能够被检测到，干涉对比度与质量成线性关系。所以质量光度法可以用于计算溶液中的分子数量，更重要的是，它与分子质量直接相关，可以用于测量分子的质量。

单分子质量光度计算可以精确测量溶液中单个分子的质量——处于原始状态、无需标记，提供了一种新的分析生物分子的方法，能够以超高的灵敏度、速度、准确度和简单性来表征你感兴趣的分子，是监测蛋白质纯化、优化样品、研究蛋白质功能和相互作用的理想仪器。