超高速原子力+NanoDSF观察TRPV3通道五聚体

 /HS-AFM/ 

在TRP通道结构与功能研究领域取得的重要进展，始于通过单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）首次解析的TRPV1通道结构。这一突破标志着冷冻电镜分辨率革命中膜蛋白结构解析的开端。截至目前，已有超过20种不同TRP通道的210余个结构被解析，所有结构均呈现四聚体组装模式（补充数据图1）。

尽管 TRPV 通道的结构信息丰富，但其门控周期的许多细节仍不清楚且存在争议，例如，热触发激活的机制、功能周期中各状态（包括敏化和脱敏状态）的结构关联以及 TRPV 通道中众多配体结合位点在配体激活机制中的作用。另一个结构上存在争议的问题涉及孔道扩张现象。这一现象在功能上已被报道存在于 TRPV1、TRPV3、TRPA1以及 TRPV2 的一个突变体中，即长时间的热和/或激动剂激活会导致电导显著增加、离子选择性丧失以及对大阳离子、三羟甲基氨基甲烷的通透性增加。通透性增加以及整流作用的丧失表明通道孔径随时间逐渐扩大。尽管典型的激活动力学很快，在毫秒范围内，但孔径的扩大则发生在秒至分钟的时间尺度上。其发生的缓慢性表明，它与典型的开放状态之间存在较大的能量障碍。因此，孔径扩大的状态在结构上与典型的激活状态有显著差异，孔径明显增大，而且在动力学上，其形成的时间尺度对于典型的蛋白质构象变化来说异常长。

为了解决其中一些未解决的问题，作者在此使用超高速视频级原子力显微镜（HS-AFM）直接在缓冲溶液中、在生理温度和压力下以约 1 秒的时序分辨率对膜嵌入的全长人 TRPV3 进行单分子水平的成像。

作者证明了 TRPV3 通道能够形成一种此前未曾观察到的五聚体状态，这种五聚体状态较为罕见、可逆且短暂：五聚体状态与四聚体状态在数秒至数分钟的时间尺度上通过膜扩散交换亚基而相互转换。作者进一步证明，在加入二苯基硼酸酐（DPBA）后，这种五聚体状态的出现频率增加了一倍，DPBA 是一种合成激动剂，已被证明能增强 TRPV3 电流并导致孔径扩张。基于对这种非典型状态及其形成方式的了解，作者调整了蛋白质生产和分析流程，从而能够以 4.4 埃的分辨率确定 TRPV3 五聚体的冷冻电镜结构，揭示出一个宽大的通道孔，比四聚体中的孔大得多。总体而言，结果表明，TRPV3 通道能够形成五聚体状态，这可能是功能上孔径扩张状态的结构对应物，并可能为 TRP 通道研究开辟新的途径。

为了进一步探究 DPBA 对 TRPV3 四聚体状态的破坏作用，作者进行了差示扫描荧光法（nanoDSF）实验，并通过检测 350 和/或 330 纳米处荧光发射随温度的变化来测量 TRPV3 的热稳定性。在 nanoDSF 实验中，测量的是蛋白质中色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）的固有荧光，其会因局部环境的变化而改变，例如温度依赖性的构象变化、寡聚体解离和/或变性。TRPV3 的热变性曲线显示出两个一阶导数峰，分别对应两个熔解温度，第一个熔解温度（Tm1）表现为反向蓝移曲线，在 55.5 ± 0.1°C 处有一个拐点，第二个熔解温度（Tm2）在 63.4 ± 0.3°C 处有一个拐点（图 4c，d）。值得注意的是，当向同一蛋白质样品中加入 320 μM DPBA 时，Tm1 降至 52.7 ± 0.6°C，Tm2 降至 61.3 ± 0.5°C。而当分别加入 32 和 100 μM DPBA 时，这些配体浓度已被证明可诱导典型的尽管激活了电流但并未增强次级电流 25，熔点更接近于无配体状态，即 Tm1 和 Tm2 分别为 55.1 ± 0.5 和 54.5 ± 0.3 摄氏度以及 63.1 ± 0.3 和 62.6 ± 0.6 摄氏度（图 4c，d）。最后，当向样本中加入 1000 μM 的 DPBA（会导致导电性崩溃的配体）时，观察到稳定性进一步显著下降，Tm1 和 Tm2 分别为 51.3 ± 1.0 和 60.5 ±0.3°（图 4c、d）。在 350 纳米和 330 纳米处的荧光红移表明内部色氨酸暴露，而荧光蓝移则内部色氨酸缺失或在热变性过程中内部酪氨酸的暴露相关。通过检查 TRPV3 结构中酪氨酸和色氨酸的分布，作者发现许多内部隐藏的色氨酸和酪氨酸，特别是许多隐藏在亚基界面处的酪氨酸（补充图 4）。作者推测 Tm1 对应于 TRPV3 低聚物的解体，表现为亚基界面处的酪氨酸暴露，而 Tm2 对应于 TRPV3 单体的变性。另一种解释可能是 Tm1 与温度感应构象变化有关，而 Tm2 与单体断裂和变性有关。无论具体事件的顺序如何，DPBA 显然影响了单体界面的完整性并使通道不稳定。因此，这些结果与添加 DPBA 后通过 HS-AFM 观察到的四聚体减少和 TRPV3 片段增加是一致的。

超高速视频级原子力显微镜（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大学 Prof. Ando 教授团队研发，日本RIBM公司商业化的产品，可以达到视频级成像的商业化原子力显微镜。HS-AFM突破了传统原子力显微镜“扫描成像速慢”的限制，能够在液体环境下超快速动态成像，分辨率为纳米水平。样品无需特殊固定，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。超高速视频级原子力显微镜HS-AFM主要有两种型号，SS-NEX样品扫描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探针扫描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今，全球已有150多位用户，发表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等顶级杂志。

差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry, DSF)是一种方便快捷的高通量药物筛选及靶标发现的方法，通过荧光染料或蛋白内源荧光信号检测升温过程中蛋白构象的变化计算其熔解温度Tm（melting temperature，Tm，也称为热变性温度）。蛋白中的色氨酸和酪氨酸可以被280 nm的紫外光激发并释放出荧光，其荧光性质与所处的微环境密切相关。蛋白变性过程中，色氨酸从疏水的蛋白内部逐渐暴露到溶剂中，荧光释放的峰值也从330 nm逐渐转移到350 nm。该方法具有蛋白样品消耗量少、通量高、温度变化范围广及数据准确等优点，被广泛用于蛋白质稳定性（蛋白质热稳定性参数及其影响因素）、蛋白结构和构象、蛋白-配体相互作用及蛋白质稳定剂、抑制剂、辅助因子等领域的研究。

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