蛋白稳定性分析仪PSA-16助力融合酶生物传感器的开发

2026-05-14 10:15:48, 北京佰司特科技北京佰司特科技有限责任公司

/融合酶生物传感器/

蛋白稳定性分析仪PSA-16（北京佰司特科技有限责任公司）助力助力齐鲁工业大学（山东省科学院）生物研究所、山东省生物传感与微生物智能代谢调控重点实验室、山东大学齐鲁医学院国家药品监督管理局药物制剂技术研究与评价重点实验室的科研人员开发肌氨酸氧化酶（SOX）生物传感器，并于2026年3月在《International Journal of Biological Macromolecules》期刊发表了题为“The role of linker on the elevated biosensing performance of a carbohydrate-binding module-tagged sarcosine oxidase”的研究论文。

蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。

蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在受热时，其结构发生变化，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用熔解温度（melting temperature，Tm，也称为热变性温度）来表示，即蛋白质解折叠50% 时的温度。

01 摘要

肌酐是评估肾功能的关键生物标志物，开发其快速、灵敏、稳定的即时检测（POCT）生物传感器至关重要。基于酶的生物传感器使用肌氨酸氧化酶（SOX）在三酶级联反应中颇具前景，但在固定化后的酶活性和长期稳定性方面仍存在挑战，尤其是对于活性较低的 SOX。在此，我们报告了对糖结合模块 3（CBM3）融合 SOX 变体的合理工程改造，以解决这些局限性。CBM3 通过不同的连接子（富含脯氨酸的 XP 连接到 N 端，α-螺旋 EAAK 连接到 C 端）与单体 SOX 基因融合，生成了 CBM3-XP-SOX 和 SOX-EAAK-CBM3。比较分析表明，SOX-EAAK-CBM3 表现出更优的可溶性表达（15.96 毫克/毫升）、增强的常温催化活性（比野生型 SOX 高 39.96% - 56.23%）以及出色的电化学稳定性（25 天，R2 > 0.99）。相比之下，CBM3-XP-SOX 遭受连接子裂解和结构不稳定，稳定性仅限于 2 天。对 N 端融合的结构指导连接子工程发现 XP 连接子中存在不稳定的 K-E-P 基序；通过截断和灵活引入甘氨酸，得到了 CBM3-XG-SOX。CBM3-XG-SOX/纤维素/铂生物传感器的电化学稳定性比亲本 CBM3-XP-SOX 提高了 7 倍（15 天），响应迅速（19 至 30 秒），对生理干扰物具有很强的抗干扰能力。血清和尿液实际样本分析证实，其准确度（回收率：96.28% - 97.88%）和精密度优于商业试剂盒，对于低或高肌酐浓度的误差更小。这项工作通过生物信息学指导的连接子/融合位点优化，为融合酶工程建立了一个合理的框架，克服了基于低活性酶的生物传感器的局限性。CBM3 融合 SOX 生物传感器能够实现经济、稳定、灵敏的即时检测肌酐，具有广泛的临床诊断和家庭健康监测应用。

在本研究中，通过端到端基因融合方法系统地构建了一系列 CBM 融合 SOX，以开发增强型生物传感元件。对影响融合酶稳定性的因素进行研究发现，N 端和 C 端连接区内的特定残基对 SOX 的结构完整性起着关键作用。在合理生物信息学分析的指导下，对这些不稳定残基进行了策略性截断，从而获得了稳定的融合酶。实验验证表明，这种优化显著提高了相应 SOX 基生物传感器的稳定性。这项工作建立了一个用于设计具有可调特性的融合酶的合理框架，为构建高性能生物传感器平台提供了一种稳健的策略。

02 内容

通过差示扫描量热法（DSF）评估了所有蛋白变体在自由溶液中的热稳定性，以测试 CBM3 融合的内在结构效应（图 S7A-D）。结果表明，野生型 SOX（图 S7A）显示出一个单一的对称熔解峰（Tm ~ 43.47℃），对应于天然结构域的变性，而 SOX-EAAK-CBM3（图 S7C）则表现出一个清晰的对称峰，其熔解温度显著升高（~46.98℃，升高 3.51℃）——这是 CBM3 通过 EAAK 连接子融合对 SOX 进行内在结构稳定化的直接指标，该连接子可最大程度地减少结构域间的空间位阻，使 CBM3 能够作为结构伴侣发挥作用，与 SOX 形成非共价的分子内相互作用，从而使其三级结构更加刚性，并减少溶液中导致变性的构象灵活性。这种对 SOX 的内在结构稳定化是其在纤维素上固定化后具有卓越长期稳定性（25 天）的关键分子基础。与此形成鲜明对比的是，CBM3-XP-SOX（图 S7B）在三次 DSF 重复实验中表现出显著的重现性差，峰形不一致，熔解转变强度变化，且有轻微的 Tm 移动；它具有不规则的多峰轮廓（在约 58.3℃、60.61℃、68.73℃、77.6℃ 有熔解转变，以及在 90℃ 以上有一个额外的峰），这是由于在 CBM3 和 SOX 之间非特异性和异质性的 XP 连接子裂解所致。在不同重复实验和单个样本内部，连接子裂解情况各不相同，从而产生了完整的融合蛋白、游离结构域和裂解片段的异质混合物，这直接导致了差示扫描量热法（DSF）重现性差，因为裂解片段在不同实验中的变性温度和强度各不相同，从而导致了协同变性

图 S7. 利用差示扫描荧光法（DSF）评估蛋白质变体的热稳定性。（A-D）分别为野生型 SOX、CBM3-XP-SOX、SOX-EAAK-CBM3 和 CBM3-XG-SOX 的DSF热稳定性曲线。

03 结论

总体而言，通过分子动力学模拟、SDS-PAGE 和差示扫描量热法（DSF）分析，初步将 CBM3 融合到 SOX N 端时连接区的不稳定性归因于 XP 刚性连接子基序，其韧性不足使其在生理压力下易于断裂。相比之下，C 端融合连接子采用了包含 EAAK 基序的α-螺旋构象——这一结构特征在保持固有刚性的同时增强了连接子的韧性。这一综合分析表明，连接子的拓扑结构和二级结构对 CBM3-SOX 融合体的功能稳定性有显著影响，含 EAAK 的α-螺旋连接子提供了最佳的机械耐受性以维持结构域的连接（图 4F2、G2）。

本研究通过合理的基因设计和生物信息学指导优化，系统地构建了 CBM3 融合 SOX 变体，以开发用于肌酐检测的高性能生物传感元件。通过研究融合位点、连接子拓扑结构和结构稳定性对酶活性、固定化效率和电化学性能的影响，我们建立了一个稳健的框架，用于工程化融合酶以适应生物传感器应用。

总之，这项工作强调了连接子设计和融合位点选择在优化 CBM 融合酶的结构稳定性和功能表现方面所起的关键作用。将 AlphaFold3 用于结构预测以及 GROMACS 用于分子动力学模拟，为结构域相互作用和连接子动态提供了宝贵的见解，从而加快了理性工程进程。所开发的 CBM3 融合 SOX 生物传感器为即时检测肌酐提供了一种有前景的替代方案，具有响应迅速、灵敏度高、长期稳定和成本效益高的特点。未来的研究方向可能包括进一步优化连接序列、探索其他 CBM 家族以及将生物传感元件集成到微型设备中，以促进临床转化和家庭应用。

04 方法

CBM3 融合 SOXs 的稳定性测定

为评估融合了 CBM3 的 SOXs 的结构稳定性，将酶溶液稀释至最终浓度为 1 毫克/毫升，置于 PBS 缓冲液（pH 值 8.0）中，在室温下孵育 7 天。每天定时取样，随后进行 SDS-PAGE 分析。

使用北京佰司特科技有限责任公司生产的PSA-16 型仪器对目标蛋白的热稳定性进行了评估。首先将样品稀释至 1 毫克/毫升的浓度。然后，将 20 微升稀释后的样品置于石英玻璃管（产品编号162301CP，同样由北京佰司特科技有限责任公司生产）中。采用线性温度扫描法，测量 330nm和 350nm处的内源性蛋白质荧光强度。温度范围为 30 至 90 摄氏度，升温速率为 1 摄氏度/分钟。根据 F350/F330 曲线的斜率计算热变性中点温度（Tm）。每个样品均进行了 3 次测量。

05 内源差示扫描荧光法（inDSF）

差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry, DSF)是一种方便快捷的高通量药物筛选及靶标发现的方法，通过荧光染料或蛋白内源荧光信号检测升温过程中蛋白构象的变化计算其熔解温度Tm（melting temperature，Tm，也称为热变性温度）。蛋白中的色氨酸和酪氨酸可以被280 nm的紫外光激发并释放出荧光，其荧光性质与所处的微环境密切相关。蛋白变性过程中，色氨酸从疏水的蛋白内部逐渐暴露到溶剂中，荧光释放的峰值也从330 nm逐渐转移到350 nm。该方法具有蛋白样品消耗量少、通量高、温度变化范围广及数据准确等优点，被广泛用于蛋白质稳定性（蛋白质热稳定性参数及其影响因素）、蛋白结构和构象、蛋白-配体相互作用及蛋白质稳定剂、抑制剂、辅助因子等领域的研究。

内源差式扫描荧光inDSF，基于蛋白质中特定氨基酸的荧光特性。这些氨基酸的荧光强度与其所处的微环境密切相关，因此，当蛋白质的结构发生变化时，这些氨基酸的荧光信号也会随之改变。不需要额外的荧光染料加入到检测体系中，利用蛋白内部芳香族氨基酸的自发光原理。不需要任何额外的标记或固定步骤，避免引入结果的不确定性。

研究发现，蛋白质分子中芳香环氨基酸在处于不同极性的微环境时 (如疏水或亲水环境中)，其被激发的内源荧光的最大发射光谱会发生位移。蛋白质中内源荧光主要来自含芳香环氨基酸如色氨酸 (Trp)，苯丙氨酸 (Phe) 和酪氨酸 (Tyr)，其中以色氨酸内源荧光最强。当它在蛋白内部时，发射光主要在330波段，当蛋白一旦去折叠，暴露在溶剂中，发出的光就会从330波长红移到350。所以通过280激发，检测330/350的比值变化，就能测量蛋白质的Tm值。

06 蛋白稳定性分析仪PSA-16

北京佰司特科技有限责任公司于2023年10月01日，推出了自主研发的第一款国产的基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF）的蛋白稳定性分析仪（PSA-16），该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。并于当年年底就成功安装了第一台设备到中牧股份兰州生物药厂。随后在2024-2025年又连续成功安装了多台到工业企业和科研单位，包括：上海近岸科技有限公司、郑州大学河南省医药科学研究院、吉林大学、辽宁大学、成都生物制品研究所有限责任公司、北京工商大学、石河子大学、北京友谊医院消化健康全国重点实验室、深圳技术大学、中国科学院深圳先进技术研究院、蓝星安迪苏南京有限公司、清华大学、成都中医药大学等，并获客户良好反馈。

北京佰司特科技有限责任公司积极服务客户，助力武汉大学、河南大学、齐鲁工业大学（山东省科学院）、中科院武汉病毒所、中国农业大学等单位合作发表多篇高质量论文（Nature子刊《npj Vaccines》、《International Journal of Biological Macromolecules》、《ACS Nano》、《Nucleic Acids Research》《Acta Crystallographica》等）。

2025年年初，北京佰司特科技有限责任公司成功出口第一台蛋白稳定性分析仪PSA-16到俄罗斯，2026年初又出口2台PSA-16到俄罗斯，开启国际市场的推广与销售。