蛋白稳定性分析仪PSA-16研究NTRC还原酶的结构

2026-03-16 11:47:04, 北京佰司特科技北京佰司特科技有限责任公司

/酶的结构研究/

蛋白稳定性分析仪PSA-16（北京佰司特科技有限责任公司）助力中国农业大学的科研人员研究了烟草弯胞菌 NADPH 依赖型硫氧还蛋白还原酶 C 的结构及其与 2-半胱氨酸过氧化物酶相互作用的分子机制，并于2026年1月在《Acta Crystallographica》期刊发表了题为“Structural study of Nicotiana benthamiana NADPH-dependent thioredoxin reductase C and its molecular mechanism of interaction with 2-Cys peroxiredoxin”的研究论文。

Jiatai Zhang, Xuehui Bai, Shaodong Dai and Zhongzhou Chen

中国农业大学生物学院动物生物技术育种国家重点实验室，北京，中国

科罗拉多大学丹佛分校斯卡格斯药学院，奥罗拉，美国

蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。

蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在受热时，其结构发生变化，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用熔解温度（melting temperature，Tm，也称为热变性温度）来表示，即蛋白质解折叠50% 时的温度。

01 摘要

NADPH依赖型硫氧还蛋白还原酶C（NTRC）在所有质体类型中普遍存在，包括叶绿体和非光合质体，是氧化还原稳态的核心调节因子。它在过氧化物抗性、氧化还原信号传导、四吡咯生物合成、淀粉代谢和光周期调节中发挥着关键作用。NTRC/2-Cys 过氧化物酶（2CP）介导的抗氧化防御系统在对抗病原体引起的生物胁迫方面也至关重要。相关研究表明，NTRC与2CP之间的相互作用对于调节和整合叶绿体中的氧化还原功能至关重要。然而，NTRC与2CP相互作用的分子机制仍不清楚。在本研究中，我们表征了烟草（Nicotiana benthamiana）NTRC（NbNTRC）的三维结构，并通过 X 射线晶体学解析了其NTR结构域的晶体结构。此外，我们还通过体外实验，包括下拉实验、尺寸排阻色谱、微量热泳动和热稳定性实验，研究了NbNTRC与Nb2CP相互作用的分子基础及稳定性。总之，我们的研究确定了两个半胱氨酸残基对于NbNTRC与Nb2CP复合物的内在稳定性以及它们之间的分子间相互作用至关重要，确定了NbNTRC NTR 结构域的结构，并为NbNTRC-Nb2CP调控复合物提供了新的机制见解。

02 内容

采用PSA和ThermoFluor检测法来评估NbNTRC 中的单个突变C473S或C476S以及Nb2CP中的C121S或C243S对各自热稳定性的影响。这两种技术均通过测定热变性温度(Tm) 来定量评估蛋白质的稳定性。

在PSA和ThermoFluor检测中，NbNTRCC473S 相较于野生型NbNTRC，其Tm仅略有下降，而NbNTRCC476S则出现了显著的降低。具体而言，NbNTRC中Cys476的突变使Tm值在PSA检测中下降了8.91℃，在ThermoFluor检测中下降了8.67℃，这表明该突变极大地削弱了其结构稳定性。同样，我们评估了Nb2CP 及其突变体的热稳定性。与野生型Nb2CP 相比，突变体Nb2CPC243S下降幅度相对较小，在 PSA检测中下降了 3.24℃，在ThermoFluor 检测中下降了 2.34℃。相反，突变体Nb2CPC121S出现了更为明显的稳定性下降，其Tm值在 PSA 和 ThermoFluor检测中，温度分别下降了6.22℃和5.5℃。值得注意的是，半胱氨酸121位于特征性的PxxxTxxC基序（Hall 等人，2010 年）内，由保守的苏氨酸（-3）和脯氨酸（-7）残基确定，表明半胱氨酸 121 是 Nb2CP 中的关键过氧化半胱氨酸（Cp）。结合我们之前关于这些半胱氨酸在介导NbNTRC-Nb2CP相互作用中的作用的研究结果，这些结果表明，NbNTRC中的半胱氨酸476和Nb2CP中的半胱氨酸121不仅对各自蛋白质的结构稳定性至关重要，而且对促进它们的功能性相互作用也起着关键作用。

图 6.

Nb2CP中的Cys121和NbTrx中的Cys476对各自蛋白质的内在稳定性至关重要。(a)通过PSA对NbNTRC、NbNTRCC473S和NbNTRCC476S 进行的热稳定性测定。每条曲线的转变温度 (Tm) 在图中均有明确标注。(b) 通过ThermoFluor对NbNTRC、NbNTRCC473S 和NbNTRCC476S 进行的热稳定性测定。(c) 通过PSA对Nb2CP、Nb2CPC121S和Nb2CPC243S进行的热稳定性测定。(d)通过ThermoFluor对Nb2CP、Nb2CPC121S和Nb2CPC243S 进行的热稳定性测定。

03 结论

在本研究中，我们采用X射线衍射晶体学（图1d和1e）确定了NbNTRC 的 NTR 结构域的结构。在每个不对称单元中，有两份NTR结构域蛋白，每份结合一个 FAD分子（图2a）。结合尺寸排阻色谱（SEC）和小角X射线散射（SAXS）实验的结果，本研究揭示NbNTRC NTR结构域蛋白主要呈现类似于晶体二聚体的构象（图 1b 和 2h）。随后，将NTR结构域与来自其他物种的 NTR结构域在Fo构象（PDB 条目 3d8x）、“中间态”构象（PDB条目7p9d）和Fr构象（PDB条目1f6m）进行了比较。结果表明，本研究解析的NbNTRC NTR结构对应于Fo构象。在此构象中，催化性半胱氨酸在异咯嗪环附近形成二硫键，有助于从还原态的FAD醌向该二硫键转移电子。

来自SEC、Pull-Dwon和MST实验的结果一致表明，Nb2CP中121 位的半胱氨酸残基以及 NbNTRC中Trx结构域内476位的半胱氨酸残基对于NbNTRC-Nb2CP复合物的形成至关重要。来自PSA和ThermoFluor 检测的结果进一步表明，NbNTRC中的Cys476和Nb2CP中的Cys121显著影响各自蛋白质的热稳定性。综上所述，这些结果表明NbNTRC Trx 中的 Cys476和Nb2CP中的Cys121（过氧化半胱氨酸）对于蛋白质的稳定性和其复合物的组装都是必需的。

最后，基于本研究的发现以及经典的OsNTRC反应机制模型，我们提出了NbNTRC的反应机制。在该模型中，NbNTRC在Nb2CP的协助下，与Nb2CP环状结构的外侧结合。这种大复合物的结构可能有利于调节氧化还原动力学。电子依次从NADPH转移到NbNTRC的NTR结构域中的 FAD分子，然后转移到NTR结构域内的活性二硫键，接着转移到相邻NbNTRC分子的Trx结构域内的活性二硫键，最后转移到Nb2CP蛋白质内的活性二硫键。

04 方法

差示扫描荧光法（DSF）

采用两种差示扫描荧光法（DSF）对目标蛋白的热稳定性进行了评估：蛋白质稳定性分析（PSA）和ThermoFluor。首先，使用PSA-16仪器（北京佰司特科技有限责任公司）对目标蛋白的热稳定性进行了测定。将蛋白质样品（0.4 毫克/毫升）装入石英样品管（货号 LG-002，北京佰司特科技有限责任公司）中进行分析（Zhou 等人，2024 年）。蛋白质的稳定性在 30 至 90℃的线性升温过程中（升温速率为 1℃/分钟），于 350 纳米处监测内在荧光信号。根据 F350 曲线的斜率计算热变性中点温度（熔解温度Tm）。每个样品测量四次。此外，我们还采用ThermoFluor法测定目标蛋白的熔解温度 (Tm)。在ThermoFluor实验中，将约 5 毫克/毫升的蛋白溶液与 SYPRO Orange 染料混合。取 20 微升置于板中，在Thermo Scientific Fluoroscan FL仪器上进行测量。在实验过程中，仪器实时监测荧光强度随温度升高的变化，生成蛋白质“熔解曲线”及其对应的导数曲线。目标蛋白的熔解温度 (Tm) 可通过熔解曲线的拐点或从一阶导数曲线的最小值。

05 内源差示扫描荧光法（inDSF）

差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry, DSF)是一种方便快捷的高通量药物筛选及靶标发现的方法，通过荧光染料或蛋白内源荧光信号检测升温过程中蛋白构象的变化计算其熔解温度Tm（melting temperature，Tm，也称为热变性温度）。蛋白中的色氨酸和酪氨酸可以被280 nm的紫外光激发并释放出荧光，其荧光性质与所处的微环境密切相关。蛋白变性过程中，色氨酸从疏水的蛋白内部逐渐暴露到溶剂中，荧光释放的峰值也从330 nm逐渐转移到350 nm。该方法具有蛋白样品消耗量少、通量高、温度变化范围广及数据准确等优点，被广泛用于蛋白质稳定性（蛋白质热稳定性参数及其影响因素）、蛋白结构和构象、蛋白-配体相互作用及蛋白质稳定剂、抑制剂、辅助因子等领域的研究。

内源差式扫描荧光inDSF，基于蛋白质中特定氨基酸的荧光特性。这些氨基酸的荧光强度与其所处的微环境密切相关，因此，当蛋白质的结构发生变化时，这些氨基酸的荧光信号也会随之改变。不需要额外的荧光染料加入到检测体系中，利用蛋白内部芳香族氨基酸的自发光原理。不需要任何额外的标记或固定步骤，避免引入结果的不确定性。

研究发现，蛋白质分子中芳香环氨基酸在处于不同极性的微环境时 (如疏水或亲水环境中)，其被激发的内源荧光的最大发射光谱会发生位移。蛋白质中内源荧光主要来自含芳香环氨基酸如色氨酸 (Trp)，苯丙氨酸 (Phe) 和酪氨酸 (Tyr)，其中以色氨酸内源荧光最强。当它在蛋白内部时，发射光主要在330波段，当蛋白一旦去折叠，暴露在溶剂中，发出的光就会从330波长红移到350。所以通过280激发，检测330/350的比值变化，就能测量蛋白质的Tm值。

06 蛋白稳定性分析仪PSA-16

北京佰司特科技有限责任公司于2023年10月01日，推出了自主研发的第一款国产的基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF）的蛋白稳定性分析仪（PSA-16），该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。并于当年年底就成功安装了第一台设备到中牧股份兰州生物药厂。随后在2024-2025年又连续成功安装了多台到工业企业和科研单位，包括：上海近岸科技有限公司、郑州大学河南省医药科学研究院、吉林大学、辽宁大学、成都生物制品研究所有限责任公司、北京工商大学、石河子大学、北京友谊医院消化健康全国重点实验室、深圳技术大学、中国科学院深圳先进技术研究院、蓝星安迪苏南京有限公司、清华大学、成都中医药大学等，并获客户良好反馈。

北京佰司特科技有限责任公司积极服务客户，助力武汉大学、河南大学、齐鲁工业大学（山东省科学院）、中科院武汉病毒所、中国农业大学等单位合作发表多篇高质量论文（Nature子刊《npj Vaccines》、《International Journal of Biological Macromolecules》、《ACS Nano》、《Nucleic Acids Research》《Acta Crystallographica》等）。

2025年年初，北京佰司特科技有限责任公司成功出口第一台蛋白稳定性分析仪PSA-16到俄罗斯，2026年初又出口2台PSA-16到俄罗斯，开启国际市场的推广与销售。