蛋白稳定性分析仪PSA-16助力内罗病毒“夺帽”内切酶研究

2026-05-14 10:15:48, 北京佰司特科技北京佰司特科技有限责任公司

/内切酶的热稳定性/

蛋白稳定性分析仪PSA-16（北京佰司特科技有限责任公司）助力中国科学院武汉病毒研究所的科研人员研究了内罗病毒“夺帽”内切核酸酶的结构与功能，并于2026年1月在《Nucleic Acids Research》期刊发表了题为“Structure and function of the nairovirus cap-snatching endonuclease”的研究论文。

Wenhua Kuang， Zhenhua Tian， Gan Zhang， Fan Wu， Jinyue Li， Jingjing Tang， Huanyu Zhang， Xinyue Zhuo， Zhihong Hu， Manli Wang， Haiyan Zhao， Zengqin Deng

中国科学院武汉病毒研究所

中国科学院大学

武汉大学生命科学学院

中国科学院水生生物研究所

湖北大学生命科学学院

湖北江夏实验室

蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。

蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在受热时，其结构发生变化，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用熔解温度（melting temperature，Tm，也称为热变性温度）来表示，即蛋白质解折叠50% 时的温度。

01 摘要

内罗病毒包括几种人类病原体，如克里米亚 - 刚果出血热病毒（CCHFV）和卡索克罗病毒（KASV）。病毒聚合酶的夺帽内切核酸酶（EN）结构域对于转录至关重要，是很有前景的抗病毒靶点。然而，内罗病毒 EN 的结构和功能机制仍知之甚少。在此，我们介绍了 CCHFV 和 KASV EN 的生化和结构研究。生化实验表明，这两种 EN 的 RNA 内切核酸酶活性可被锰离子激活，并且对富含尿嘧啶的 RNA 底物表现出偏好。这种活性可被三种金属螯合抑制剂（DPBA、L-742，001 和 BXA）抑制，其中 BXA 显示出最高的结合亲和力和抑制效力。我们还确定了 CCHFV 和 KASV EN 在无配体、金属离子结合和抑制剂结合状态下的九个晶体结构。比较结构分析揭示了内罗病毒 EN 独有的双金属离子结合模式，其中保守残基通过桥接水分子协调两个锰离子。在 KASV EN 与抑制剂结合的结构中，BXA 与酶形成了额外的稳定作用力，这解释了其更强的抑制效果。功能测定进一步证实，双金属离子机制对于病毒转录至关重要。这些发现为针对克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）及相关病原体的抗病毒药物的合理设计提供了结构基础。

02 内容

KASV EN 的生化及酶学特性研究

两种具有 His+ 和 His− 基团的核酸内切酶都需要二价金属离子才能发挥催化活性。为了确定内罗病毒内切酶（EN）的金属离子结合特异性，进行了差示扫描荧光（DSF）实验以检测不同条件下蛋白质的稳定性。KASV EN 在无金属离子的情况下显示出典型的热变性曲线，其熔解温度 (Tm) 为 42.3℃。加入 MnCl₂ 或 MgCl₂ 后，其熔解温度分别升高了 4.7℃ 和 2.9℃（图 2A），这可能是由于金属离子结合在活性位点所致。在存在 Co2+、Zn2+ 或 Ni2+ 的情况下观察到了异常的热变性曲线（补充图 S1A），这可能是因为这些离子导致蛋白质聚集或降解。动态光散射（DLS）分析表明，加入这三种离子中的任何一种都会导致内切酶的平均流体动力学直径显著增加，表明样品中发生了蛋白质聚集。在 MnCl2 和三种已知的内切酶抑制剂存在的情况下，进一步进行了 DSF 实验。DPBA 和 L-742，001 均使熔解温度 Tm 升高了约 10℃，超过了单独使用 MnCl₂ 时的稳定性（熔解温度Tm 为 4.7℃）。值得注意的是，BXA 对 KASV内切酶的稳定作用最为显著，使 Tm 提高了 16.8℃（图 2A）。这些结果表明，KASV EN 能够与 Mn2+ 和 Mg2+ 结合，并且在测试的抑制剂中可能与 BXA 的相互作用最为强烈。

KASV EN 达到完全的催化活性要两种金属离子

为了证实结构发现，我们在内切酶八个保守的活性位点残基上进行了单点丙氨酸突变，以研究它们对金属离子诱导的蛋白质稳定性和催化活性的影响。正如预期的那样，突变 D719 完全消除了金属离子诱导的稳定作用（ΔTm = -0.7℃），这与它直接与 Mn1 和 Mn2 配位相符。在 E668 和 E682 处的突变，这两个残基间接参与了两个金属离子的结合，也降低了稳定性（ΔTm 分别为 0.8℃和 1.7℃），与野生型相比（ΔTm = 5.1℃），表明这些残基对于最佳金属结合至关重要。相比之下，在 P718、K841 和 K848 处的突变对内切酶稳定性的影响极小（图 4B 和表 1），这可能是由于它们对金属离子结合的贡献有限。E831A 和 W849A 突变体显示出非典型的热变性曲线（补充图 S1B），这可能是由于在热变性过程中发生了内切酶聚集或构象不稳定所致。通过动态光散射（DLS）测定进一步证实了这一点，结果显示在较高温度（40℃）下，两个突变体的颗粒大小均显著增大，与野生型（WT）相比差异明显（补充图 S1D 和 E），表明在加热过程中发生了聚集。我们还使用等温滴定量热法（ITC）检测了 Mn2+ 与 WT、D668A 和 D719A 突变体的结合情况（补充图 S5）。WT 和 D668A 的滴定曲线数据能很好地用单位点结合模型拟合，分别得到 Kd 值为 25.4 和 163.0 μM，而 D719A 则完全失去了与 Mn2+ 的结合。D668A 与 WT 相比结合亲和力降低，表明该突变破坏了结合位点。这些观察结果与热稳定性测定和结构观察的结果基本一致。

同时，我们使用单链 RNA 底物在 Mn2+ 存在的情况下研究了这些突变体的内切核酸酶活性。关键金属离子配位残基（E668、E682、D719 和 E831）的突变显著降低了内切酶活性。而假定的催化残基 K841A 虽然仍具有活性，但活性水平低于野生型，这表明它对内切酶活性有贡献但并非必不可少。P718、K848 和 W849 的突变对内切酶活性没有影响，这与它们在金属离子配位中的作用很小或没有作用相符。综上所述，这些发现表明，参与配位两个金属离子的保守残基对于金属离子结合和 EN 催化活性都至关重要。

这些结构观察结果与热稳定性和内切酶活性测定的生化数据完全一致。综合来看，生化和结构数据共同表明 D719 是协调两个金属离子以及催化活性的关键残基，支持了结合两个金属离子对于内切酶的全部功能至关重要这一观点。

图 2. KASV EN 的热稳定性和二价金属离子依赖性活性。 (A) 在无离子和存在指定二价金属离子及抑制剂的情况下，KASV EN 的热变性曲线。

MnCl₂ 或 MgCl₂组分别与无离子对照组进行比较，而抑制剂处理组与 MnCl₂ 组进行比较。

图 4. KASV EN 具有独特的双金属离子结合模式，这对催化活性至关重要。(B) KASV EN WT 及其突变体在有无 MnCl₂ 下的热稳定性。值表示为三次独立实验的平均值 ± 标准差。通过双向方差分析评估了无离子组和 MnCl₂ 组之间差异的统计学意义。

03 结论

热稳定性测定表明，KASV EN 可以结合 Mn2+ 和 Mg2+；然而，在存在 Mg2+ 的情况下未观察到可检测的酶活性。这些发现与之前的多项研究结果一致，在这些研究中，大多数病毒性内切酶在 Mn2+ 下表现出的活性明显高于在 Mg2+ 下的活性。这种偏好可能归因于这样一个事实，即 Mn2+ 的离子半径更小，且其配位要求也比 Mg2+ 更宽松，这可能会有利于形成有利于催化作用的配位几何结构，并为底物结合提供更大的灵活性。然而，即使在 Mn2+ 存在的情况下，分离的内罗病毒内切酶在体外仍表现出低活性，这表明有效的 EN 活性可能需要全长 RNA 聚合酶的结构或功能环境。

在本研究中，直接或间接参与锰离子配位的残基发生突变会损害 KASV内切酶的活性，以及在基于 CCHFV 的迷你复制子系统中的转录活性。对失活突变体的结构分析显示，金属离子结合部分或完全丧失。这些发现表明，内切酶活性高度依赖于两个金属离子的结合，表明内罗病毒内切酶采用类似于其他夺帽内切核酸酶的双金属离子催化机制，尽管其金属离子配位模式有所不同。

双金属离子催化已被确立为许多核酸酶的通用机制，其中两个金属离子（分别称为金属 A 和金属 B）在催化循环中发挥着不同的作用。值得注意的是，这两个金属离子可以相互重新定位。

夺帽内切核酸酶已成为抗病毒药物开发的有前景靶点。我们系统评估了三种代表性抑制剂对喀山沙粒病毒（KASV）和克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）内切酶的抑制效果。结果表明，在三种测试化合物中，BXA 的结合亲和力最高，抑制活性最强（图 5 和补充图 S7）。

总之，我们的研究首次从原子分辨率层面揭示了内罗病毒的内切酶的结构。对克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）和肯尼亚塞夫病毒（KASV）内切酶的一系列高分辨率结构研究表明，一种独特的双金属离子结合模式对于其酶活性至关重要。这种独特的配位方式涉及多个桥接水分子，对高效催化以及适应不同底物或环境条件具有特定意义。重要的是，这种双金属离子模式在内罗病毒的内切酶中是保守的，并且容易受到现有内切酶靶向化合物的抑制。这些发现为开发针对克里米亚-刚果出血热病毒及其他相关内罗病毒的新型、高效、广谱抗病毒药物提供了关键基础。

表 1. 热稳定性、内切酶活性以及突变体的转录活性。

a. Tm 在无离子存在以及 2 mM MnCl₂ 存在的情况下，根据 DSF 测定计算得出的值。

b. 通过体外内切酶活性测定。

c. 通过CCHFV微型复制子测定法。

NA代表无数据。

04 方法

使用 PSA-16 仪器（北京佰司特科技有限责任公司）测定了纯化的 KASV EN 及其突变体的差示扫描荧光（DSF）热变性曲线。将蛋白质样品稀释至 0.3 毫克/毫升，加入测定缓冲液（20 毫摩尔/升 Tris-HCl，pH 7.5，150 毫摩尔/升 NaCl，5% 体积比的甘油），并添加 2 毫摩尔的各种二价金属离子，或添加 0.2 毫摩尔的抑制剂（DPBA、L-742，001 和 BXA）以及 2 毫摩尔的 MnCl₂。在30℃至 95℃的线性升温范围内，以每分钟 1℃的升温速率监测 330 纳米和 350 纳米处的内在蛋白质荧光强度。F350/F330 荧光比值曲线的一阶导数计算出熔解温度 (Tm)。

05 内源差示扫描荧光法（inDSF）

差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry, DSF)是一种方便快捷的高通量药物筛选及靶标发现的方法，通过荧光染料或蛋白内源荧光信号检测升温过程中蛋白构象的变化计算其熔解温度Tm（melting temperature，Tm，也称为热变性温度）。蛋白中的色氨酸和酪氨酸可以被280 nm的紫外光激发并释放出荧光，其荧光性质与所处的微环境密切相关。蛋白变性过程中，色氨酸从疏水的蛋白内部逐渐暴露到溶剂中，荧光释放的峰值也从330 nm逐渐转移到350 nm。该方法具有蛋白样品消耗量少、通量高、温度变化范围广及数据准确等优点，被广泛用于蛋白质稳定性（蛋白质热稳定性参数及其影响因素）、蛋白结构和构象、蛋白-配体相互作用及蛋白质稳定剂、抑制剂、辅助因子等领域的研究。

内源差式扫描荧光inDSF，基于蛋白质中特定氨基酸的荧光特性。这些氨基酸的荧光强度与其所处的微环境密切相关，因此，当蛋白质的结构发生变化时，这些氨基酸的荧光信号也会随之改变。不需要额外的荧光染料加入到检测体系中，利用蛋白内部芳香族氨基酸的自发光原理。不需要任何额外的标记或固定步骤，避免引入结果的不确定性。

研究发现，蛋白质分子中芳香环氨基酸在处于不同极性的微环境时 (如疏水或亲水环境中)，其被激发的内源荧光的最大发射光谱会发生位移。蛋白质中内源荧光主要来自含芳香环氨基酸如色氨酸 (Trp)，苯丙氨酸 (Phe) 和酪氨酸 (Tyr)，其中以色氨酸内源荧光最强。当它在蛋白内部时，发射光主要在330波段，当蛋白一旦去折叠，暴露在溶剂中，发出的光就会从330波长红移到350。所以通过280激发，检测330/350的比值变化，就能测量蛋白质的Tm值。

06 蛋白稳定性分析仪PSA-16

2023年10月01日，北京佰司特科技有限责任公司推出了自主研发的第一款国产的基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF）的蛋白稳定性分析仪（PSA-16），该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。并于当年年底就成功安装了第一台设备到中牧股份兰州生物药厂。随后在2024-2025年又连续成功安装了多台到工业企业和科研单位，包括：上海近岸科技有限公司、郑州大学河南省医药科学研究院、吉林大学、辽宁大学、成都生物制品研究所有限责任公司、北京工商大学、石河子大学、北京友谊医院消化健康全国重点实验室、深圳技术大学、中国科学院深圳先进技术研究院、蓝星安迪苏南京有限公司、清华大学、成都中医药大学等，并获客户良好反馈。

北京佰司特科技有限责任公司积极服务客户，助力武汉大学、河南大学、齐鲁工业大学（山东省科学院）、中科院武汉病毒所等单位合作发表多篇高质量论文（Nature子刊《npj Vaccines》、《International Journal of Biological Macromolecules》、《ACS Nano》、《Nucleic Acids Research》等）。

2025年年初，成功出口第一台蛋白稳定性分析仪PSA-16到俄罗斯，2026年初又成功出口2台PSA-16到俄罗斯，开启出口海外销售的发展战略。