非靶向代谢组学和质谱成像揭示丹参代谢特征及生物合成途径机理

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研究背景

代谢物的空间分布及其结构是解释植物生物合成途径复杂性的两个关键方面。代谢组学联合质谱成像技术，研究鼠尾草属植物丹参的生物合成途径，并获取空间代谢组信息。对了解生物活性代谢产物的积累和生物合成，探索生物活性成分的形成机制、保证药材质量至关重要。

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前言

2022年01月，第二军医大学陈万生教授在Talanta期刊发表的题为“Biosynthesis-based spatial metabolome of Salvia miltiorrhiza Bunge by combining metabolomics approaches with mass spectrometry-imaging ”（IF：6.556）的研究成果，通过非靶向代谢组学、DESI-MSI质谱成像等技术的研究方法，探究了丹参生物合成途径机理和代谢分布图谱，为鼠尾草属的丹参生物合成提供了理论依据。

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基本信息

中文标题：LC-MS结合质谱成像技术研究丹参活性物质的生物合成

研究对象：丹参

发表期刊：Talanta

影响因子：6.556

发表时间：2022年1月

合作单位：第二军医大学

运用生物技术：非靶向代谢组学、DESI-MSI质谱成像技术、LC-MS

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研究思路

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研究方法

1. 实验材料

丹参来源：Salvia deserta, Salvia officinalis, Salvia chinensis, Salvia trijuga, Salvia yunnanensis, Salvia columbariae, Salvia daghestanica, and Salvia madrensis

化学试剂：乙腈、甲醇、甲酸、氯仿、纯蒸馏水，华法林、亮氨酸脑啡肽、纯净水等

标准品：芦丁、山奈酚、山奈酚-3- O-β-芦丁苷、山奈酚3-O-D -葡萄糖苷、芹菜素、槲皮素-3- D-葡萄糖苷、丹参素、丹酚酸C、丹酚酸E、丹参酮I、丹参酮IIA、杉酚醇、丹参醇A、苯醌C、米替酮、3-羟甲基丹参酮、隐丹参酮、丹参醇B、丹酚酸A、丹酚酸B、咖啡酸、迷迭香酸、石精酸

2.技术路线

2.1 LC-MS样品制备分析：丹参根、茎、叶、花粉末超声离心， UHPLC-QTOF-MS分析

2.2 DESI-MSI样品制备：根和茎的冷冻切片、叶子和花印迹法制备

2.3 LC-MS和DESI-MSI分析：ACQUITY UPLC系统、Xevo G2 - XS QTOF质谱仪

2.4代谢组学数据处理：ABF  MS-DIAL软件

2.5 优化分析：PCA、OPLS-DA

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研究结果

1. 丹参不同部位代谢特征的研究

对丹参根、茎、叶和花进行LC-MS分析。MS-DIAL进行峰值检测、归一化，并生成负离子和正离子峰值表。确定637种负离子和正离子模式的代谢物，代谢物类型主要为酚酸、丹参酮、类黄酮、脂类、碳水化合物、羧酸和萜类。热图显示地上部分代谢产物多样性明显增强，尤其是叶片中酚酸、脂类和萜类物质。酚酸作为主要的代谢产物存在于所有植物部位，但这四个部位之间可能存在不同的含量和类型（图1A-B）。

PCA和OPLS-DA区分植物部位，特别是地下部分和地上部分的差异(图1C-F)。OPLS-DA分析图显示地下部分和地上部分的代谢物谱存在差异，除了丹参酮在根部富集外，两种常见的酚酸RA和SAB在地上部和地下部的积累模式不同，表明丹参不同部位的生物合成途径可能不同（图1G-H)。

图1 | 不同丹参植物的代谢组学和化学计量学分析结果

2. 代谢组学指导下的DESI-MSI仪器参数优化

基于正交阵列实验设计和化学计量分析，建立了DESI-MSI参数(图2A-E)。根据DESI-MSI数据，通过Pearson相关系数(P≥0.6)比较正离子模式下图像强度最高、位置合适的图像并快速评估，根据代谢组学数据进行代谢物识别(图2C，S7和S8)。9次试验中检测到的所有代谢物为标准，在负离子和正离子模式下进行参数优化，以获得最佳理论条件(表S5和S6)。

SIMCA-P软件分别导入正、负离子模式下鉴定的代谢物，并进行PCA分析。试验-7设置的参数最适合分析不同类别的代谢物（图2D），试验-9设置的条件为正离子模式下的最佳条件。通过对富含酚酸和丹参酮的根样品冷冻切片进行DESI-MSI分析，验证了理论和最佳实验条件。表明在负离子和正离子模式下，试验-7和试验-9的最佳实验条件均可获得高灵敏度，特别是对丹参酮的检测 (图2E)。

3. DESI-MSI样品制备的优化

采用叶片样品来优化样品制备，以叶片中丰富的RA DESI-MSI信号强度作为比较四种制样方法的基准。在未处理和氯仿洗涤的样品中均未观察到RA信号，说明即使用氯仿洗涤叶片，也无法探测到酚酸（图2F）。人工去除蜡质层时使用镊子很容易破坏组织的完整性，但在人工处理和印迹处理的样品中均检测到RA明显的MS信号（图2F)。采用印迹法制备植物样品，规避了样品厚度限制，避免了除蜡步骤(图2H)。PTFE膜印迹法是探索细胞液中可能产生的代谢物的最佳方法，而这些代谢物不能通过简单的去除蜡角质层来检测。对于较厚的组织，如根不建议采用印迹法，因为样品会扭曲PTFE膜的平整度，可能会扰乱成像过程，对成像结果产生显著影响(图2G)。综上所述，样品厚度和尺寸是用于DESI-MSI分析植物样品制备方法的两个关键因素。

图2 | DESI-MSI仪器参数优化及样品制备

4. 丹参中多种代谢物的可视化和空间分布

DESI-MSI生成了数千张图像，而图像的庞大体积对内容的视觉评估变得混乱。基于空间分布，采用Pearson相关系数（P≥0.6）的滤波器快速筛选真实图像。筛选出根、茎和花中12种不同代谢物空间分布的63张图像(图3和S9-S12)。酚酸在丹参皮层中含量丰富，但在韧皮部和木质部也有显著分布(图S9)。正离子模式下，丹参酮仅在周皮中检测到，这可能对根组织的保护起重要作用(图S9)。地上部分代谢产物种类较多，主以酚酸类代谢产物为主。茎中检测到的酚酸分布在皮质的外层，其中酚酸富集于整个皮质表面；茎中代谢物除酚酸以外，主要分布在髓质中。黄酮类化合物在花瓣上下唇间分布不同，参与三羧酸循环的丁二酸和柠檬酸主要分布在花托内，与花发育过程中花瓣的生长和脱落有关(图3和S12)。

图3 | DESI-MSI检测12种不同空间分布的代谢物

5. 丹参花类黄酮生物合成代谢途径

代谢组学显示，叶片中观察到多种类黄酮代谢产物，而在花中含量更高。由于在分析过程中4-香豆醇-乙酰辅酶A的电离较差，及柚皮素查尔酮的痕量水平，代谢组学检测不到两种上游前体。在柚皮素下游，DESI-MSI结果显示，芹菜素及相应的糖苷分布在花瓣的上唇和下唇。黄酮类化合物B环结构的改变也使芦丁分布在花瓣下唇，黄酮C-3位的羟基化形成黄酮醇是改变黄酮分布的关键反应，这可能与FLS基因有关。部分黄酮苷元由于微量的原因无法获得空间图像，但可通过图像预测空间分布相应的糖基化形式。表明代谢组学和DESI-MSI方法有助于推断代谢和遗传信息之间的关系(图4)。

 图4 | 丹参花类黄酮类化合物生物合成的空间代谢组学

6. 丹参中酚酸生物合成的代谢途径

通过对丹参根部¹³C微量元素的分析，证明通路1和通路3有助于RA的生物合成。RA生物合成的三个直接前体中，中间体L1在根中积累较多，L2和L3主要在花中积累。叶片产生了相对丰富的RA，说明其他途径可能控制着RA在不同植物部位的生物合成。作为产生RA的直接前体，丹参素和咖啡酸的含量高于L1、L2和L3三种中间体。通过与咖啡酸比较，丹参素与RA的相对含量在四种植物部位中具有相似的分布。咖啡酸除了作为酚酸生物合成的底物外，还参与多种咖啡基衍生物的生物合成，表明丹参素可能在特定的咖啡基衍生物的生物合成中发挥作用(图5A)。

图5 | LC-MS 结合DESI-MSI探测丹参中酚酸含量

L1有痕量含量，可能不是鼠尾草中RA合成的主要途径。与L2相比，丹参素和L3的积累模式与根和叶之间的RA呈正相关，表明丹参素参与的途径3、途径4是丹参素生物合成酚酸的主要途径。根据代谢组学和DESI-MSI结果，推测通路-4是鼠尾草产生RA的核心生物合成途径，丹参素是酚酸特异性生物合成的关键前体（图6）。

图6 | 9种鼠尾草叶和根代表性酚酸的相对含量

两种咖啡酸修饰物的断裂模式，表明由于杂环化时产生的2 Da质量差而存在呋喃环。酚酸在植物各部位的积累情况说明杂环化主要发生在根部。其他8种鼠尾草中，3种带有呋喃环的酚酸主要聚集在丹参根部，说明杂环化是丹参和其他遗传接近物种的根中特定酚酸形成的基础。丹参根中累积了含呋喃环的酚酸和丹参酮，这可能是丹参用根入药的独特药理作用。特殊的杂环代谢物也可作为标记鼠尾草属的生物活性物质，并加以利用（图7）。

图7 | 地下部分和地上部分酚酸的结构差异

丹参黄酮类化合物生物合成的C-3羟基化反应导致黄酮类化合物重新分布到花的花瓣下唇。丹参素可能是产生酚酸的重要前体。此外，杂环化是根中产生杂环酚酸的关键反应，这导致了根与地上部分的酚酸含量差异。

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研究结论

基于LC-MS代谢组学结合DESI-MSI，高灵敏度和可视化的优势揭示了鼠尾草属丹参不用部位的空间分布和代谢信息。可视化的代谢组学分析技术对探究特定生物活性代谢物和合成途径，活性成分的形成机制、保证药材质量，对进一步挖掘其功能核心基因起到重要作用。