项目文章 | Cell 子刊（IF：16.988）空间代谢组+空间转录组联合单细胞转录组揭示受损大脑中复杂的转录及代谢调剂

尽管单细胞转录组技术在中枢神经系统研究中有着重要作用，但是它没办法提供空间（解剖学）以及代谢（生理学）信息。目前，空间多组学技术的蓬勃发展，为更深入了解中枢神经系统变化提供了有力支持。因此，本研究通过整合空间全向信息（转录、代谢）来构建人类受伤大脑的功能类型图谱，说明了空间多组学方法在全脑综合分析中的广阔潜力，可以很好地揭示组织中功能图谱的空间组成、细胞群的异质分布以及基因和代谢物的空间特异性分布，获得复杂而完整的基因、代谢物空间表达图谱，具有非常重要的研究价值。

2023年5月31日，上海市浦东新区人民医院神经外科郑平教授在Cell Reports Medicine期刊（IF：16.988）发表题为“Integrated spatial transcriptome and metabolism study reveals metabolic heterogeneity in human injured brain”的研究成果。文章通过采用单细胞测序、空间转录组测序及AFADESI空间代谢组技术，对创伤性脑损伤患者的大脑样本进行了空间多组学分析，发现了一个受伤神经元的脂质过氧化区域，以及不平衡的肌醇和肌醇磷酸酯以及相关的空间标记。结果突出了受伤大脑中复杂的转录组调节和代谢改变，并将直接促成设计试剂，以针对人脑中的特定基因进行功能分析。

研究材料：

1）六例创伤性脑损伤患者的脑组织；

2）胶质母细胞瘤及脑膜瘤样本；

3）大鼠大脑；

研究技术：

1）AFADESI空间代谢组；

2）空间转录组；

3）单细胞测序；

4）核磁共振；

5）免疫组化；

1. 单细胞联合空间转录组学揭示了受伤大脑的不同分子区域化

通过对人类创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）患者的脑组织进行单细胞测序，降维聚类及细胞注释，鉴定出B细胞、内皮细胞、颗粒细胞、小胶质细胞、壁细胞、中性粒细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞、少突胶质细胞和T细胞（图1A，B）。通过差异基因及富集，发现在重度TBI中上调的基因主要富集在感染和免疫状态，包括Th1、Th2和Th17分化等（图1C），而下调的基因则富集在神经炎症，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号、白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、HIF-1和核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信号（图1D）。

图1 脑损伤样本的不同细胞亚型

由于在不同程度的脑损伤中发现了不同的细胞分布，因此作者使用空间转录组探究空间异质性。为了更好地观察中度和重度TBI的分子区域化，作者使用胶质瘤和脑膜瘤样本作为参考（图2A和2B），通过降维聚类进行分群，并与空间切片相对应（图2A）发现，胶质瘤和脑膜瘤组织被分别富集在cluster 3和cluster 4。SLC47A2、C11orf88、MAP3K19和ADGB在胶质瘤组织中高表达，而Preg4、BMP5、SIX2和FOXD2在脑膜瘤组织中表达增加。

图2 空间转录组和空间代谢组的聚类分析

但是这些基因在之前的研究中并没有被描述为脑损伤区域的标志物，因此，作者使用空间转录组来验证它们的区域性表达。通过空间转录组区分了中度和重度脑损伤的细胞区间的分层，并且不同分层聚类成了不同的cluster（图3A和3B）。

图3空间转录组和空间代谢组的聚类分析

此外，通过addmodulescore进行细胞类型打分发现中度和重度TBI之间的小胶质细胞、NK细胞、T细胞和少突胶质细胞的分布不同（图3C-3F）。在空间转录组细胞类型鉴定过程中，addmodulescore是一种非常常用的手段，进行空间转录组分析的老师可以参考一下。

2. 通过代谢物相关基因对脂质过氧化和神经元损失进行可视化分析

通过差异基因功能富集，作者发现上调的基因在髓鞘生成、管蛋白结合、tau蛋白结合、花生四烯酸代谢和脂质代谢中富集（图3G和3H），而下调的基因在糖酵解过程、糖皮质激素受体结合、谷氨酸代谢和糖元生成中占优势（图3I和3J）。由于发现大量代谢相关通路富集，而传统代谢研究并未展示出空间位置以及异质性问题，因此，作者使用AFADESI空间代谢组技术检测代谢物的空间分布，利用UMAP以及聚类分析发现，空间代谢组的结果与空间转录组结果相当一致（图2C）。由于前文的空间转录组结果发现，发现过氧化相关的基因如S1PR5和SEPTIN4主要在重度TBI组中表达（图4A和4C），因此，作者将这两个基因高表达的区域映射到空间代谢组上，发现，S1PR5定义的结构中PC(44:7)的丰度较高，这是一种脂质标记，被称为脂质过氧化（图4B）。相比之下，SEPTIN4定义了神经元损失区（图4D），其特点是天冬氨酸（aspartic acid）的丰度较低(图4D)。有文献报道肌醇（Myo-inositol，MI）在脑损伤中增加。

图4基于S1PR5和SEPTIN4空间标记基因的

空间转录组和代谢物之间的联系

因此，作者进一步调查了MI的分布，发现了MI和MI 1-磷酸的互补表达，其中MI的高表达区有MI 1-磷酸的低分布，反之亦然（图5D和5F）。而MI的高丰度区与空转结果的cluster 1和8相当一致，而这两个cluster中，SLC5A3（也叫钠/MI交换转运体1）在中度TBI组高表达（图5A-5C），SLC5A11（也叫钠/MI交换转运体2）在重度TBI组高表达（图5E、5G和5H），这与MI和MI 1磷酸的分布一致。

图5 基于SLC5A3和SLC5A11空间标记基因的空间转录组与代谢物之间的联系

在以往的研究中，作者发现海因酸（kainic acid，KA）可以诱导神经元损失，并增加啮齿动物海马的mINS水平，这是一个癫痫后状态（post-status epilepticus，postSE）的模型。在本项研究中，作者也用大鼠模型进行了验证，发现KA处理的大鼠的NAA/Cr减少，mINS/Cr增加（图6A-6D）。此外，免疫组化（IHC）结果验证了大鼠受伤大脑中S1PR5和SEPTIN4的蛋白质表达增加（图6E）。同样，SLC5A3和SLC5A11在大鼠受伤大脑中的表达也通过IHC得到验证（图6E）。

图6 磁共振波谱（MRS） IHC和通路

接下来，作者考察了SLC5A3、SLC5A11和MI水平之间的线性关系。首先，通过featureplot以及小提琴图展示SLC5A3和SLC5A11的表达位置，前者主要在内皮细胞中表达，后者表达在少突胶质细胞和内皮细胞及免疫细胞中（图7A-7D）。这两种基因都是肌醇和葡萄糖的转运体，其中SLC5A11与细胞凋亡有关。通过组间比较（中度TBI和重度TBI），发现SLC5A3在重度TBI组的相对表达量较低，而SLC5A11在重度TBI组的表达量比中度TBI组要高（图7E-7H）。同时，相关性分析发现，SLC5A11的表达与MI（图7J）和PC（44:7）水平（图7P）之间存在正相关关系。

图7 TBI中SLC5A3、SLC5A11和代谢物之间的关系

由于作者在脑损伤样本中发现了异质性的转录组和代谢物，于是作者通过对空间代谢组数据分为高PC区和低PC区，并将区域映射到空间转录组数据上，发现，区域间的差异基因主要富集于减少的突触和神经元突起，这表明脂质过氧化可能对突触的形成和神经元的发育有影响。SLC5A11、S1PR5和SEPTIN4的在重度TBI组表达量增加（图S2A）。上调的基因富集在醚脂代谢和组氨酸代谢（图S2B），而下调的基因富集在突触、神经元细胞体和ATP活性等通路（图S2C）。而通过以上富集结果，发现这些差异基因主要富集的通路与空间代谢组结果相当一致（图S2）。

另外，作者也用同样的策略，将样本根据空间代谢组结果分为高天冬氨酸组和低天冬氨酸组，发现差异基因也富集于突触活性降低，同时激活了突触囊泡和轴突发生（图S3）。SLC5A11、S1PR5和SEPTIN4的表达在严重TBI组有所增加（图S4A）。上调的基因富集在髓鞘生成、髓鞘、磷脂酶D信号等通路（图S4B），而下调的基因富集在突触、ATP代谢过程和神经变性等通路（图S4C）。通过以上富集结果，发现这些差异基因主要富集的通路与空间代谢组结果相当一致（图S4F）。

此外，同样的策略也应用于磷酸化MI（phosphorylated MI，pMI）和MI的比较，作者发现，SLC5A11、S1PR5和SEPTIN4的表达在重度TBI组增加（图S6A）。上调的基因富集于髓鞘生成、髓鞘和神经胶质生成（图S6B），而下调的基因富集于突触、ATP代谢过程以及神经变性和突触传递的通路（图S6C），差异基因的KEGG富集结果再次表明，空间转录组的富集途径（图S6F）与空间代谢组中的KEGG结果（图S5F）相当一致。

本项研究证实，空间转录组和空间代谢组可以结合起来绘制临床相关的基因和途径。本文表征了脂质过氧化亚组的基因与受损脑区的神经元损失有关。由于严重的脂质过氧化，受伤的脑区可能由于血液药物浓度下降而导致治疗反应降低。本文数据表明，与中度创伤性疾病患者相比，重度创伤性疾病患者的脂质过氧化和MI水平增加，这可能导致他们对综合疗法的反应不佳。

这是国内第二篇空间代谢组和空间转录组联用解决具体科学问题的文章。上海欧易生物提供了单细胞测序及空间转录组技术，上海鹿明生物提供了AFADESI空间代谢组技术，并得到了作者的致谢。空间代谢组技术可以为进一步探究处理后代谢物空间分布变化提供有力帮助。通过与其他技术（如空间转录组、蛋白组等等）联用，可以为解决科学问题提供新的研究方式和思路。

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参考文献：10.1016/j.xcrm.2023.101057