项目文章 | 上海农科院食用菌研究所运用iTRAQ蛋白质组学探究草菇采后衰老机制

2022-12-13 09:58:52, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

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2022年8月，上海市农业科学院食用菌研究所赵妍研究员团队在Journal of fungi(Basel,Switzerland)期刊（IF：5.724）发表了题为 “Comparative Proteomics Study on the Postharvest Senescence of Volvariella volvacea ”的研究成果，通过iTRAQ标记定量蛋白质组学研究方法，发现了草菇采摘前后衰老的一些相关生物学过程，探究草菇衰老过程的机理，为进一步研究草菇衰老机制提供了理论依据。

中文标题：草菇采后衰老的蛋白质组学比较研究

研究对象：草菇

发表期刊：Journal of fungi(Basel,Switzerland)

影响因子：5.724

发表时间：2022年8月

合作单位：上海市农业科学院食用菌研究所

运用组学技术：iTRAQ标记定量蛋白质组学(由鹿明生物提供技术支持)

研究背景

衰老是果实发育的最后阶段，伴随着果实风味、果皮颜色、质地、病原体敏感性和生化成分的剧烈变化。食用菌采后衰老严重影响其商业价值。采后15 °C贮藏能够提高草菇的贮藏品质，但要实现草菇的长途运输、市场流通和最大商业价值，适宜的温度是不够的。

蛋白质组学可用来研究果实成熟过程中蛋白质组成和丰度变化以及采后处理对果实蛋白质组的影响。蛋白质组学技术的进步使研究人员能够定量测量复杂样品中的蛋白质组学变化。特别是，基于相对和绝对定量（iTRAQ）定量蛋白质组学的同量异位标签已成为首选的有力工具，因为它们由于分子量、等电点或疏水性的限制而覆盖多种蛋白质。同时，iTRAQ技术尚未用于评估15 °C下草菇的采后衰老。本研究选择了四个时间点，即0，24，60和96 h，运用iTRAQ技术的比较蛋白质组学研究。从蛋白质组学的角度，揭示了草菇采后贮藏过程中蛋白质组在15 °C下的动态变化，为开发抑制草菇衰老的酶抑制剂提供了理论依据。

研究思路

研究结果

1.生理、表型和质构分析

结果表明，草菇在60-96 h硬度逐渐显著（图1A），在96 h时硬度最为显著（图1B）。草菇的结构在60-96 h相对于贮藏期开始时的结构发生了显著变化。在24 h贮藏期间，草菇的外观没有明显变化（图1C）。随着贮藏时间的增加，草菇表面出现褐变，并逐渐腐烂。这可能是由于草菇中水分的流失，细胞膜的破坏以及草菇采后贮藏期间自我调节的下降引起的。

图1 | 不同贮藏期伏尾弧菌子实体硬度

（A）（B）脆性和（C）表型的变化。每个条形表示各个样本的平均±标准误差，* 表示p< 0.05。

2.DEP 的识别

对贮藏0、24、60和96 h采集的样品进行基于iTRAQ标记定量蛋白质组学分析，了解15 °C贮藏过程中草菇的蛋白质组学变化。共鉴定了2063种可靠的蛋白质。图2显示了S24–S0，S60–S0和S96–S0中蛋白质的差异表达模式。如图 3 所示，DEP 随存储时间的增加而增加。在 S24-S0 组中，鉴定出 54 种上调蛋白（图 3 C）和 170 种下调蛋白（图 3 B），共 224 个 DEP（图 3A）。在 S60–S0 组中，共检测到 160 个上调蛋白（图 3 C）和 302 个下调蛋白（图 3 C），共 462 个 DEP（图 3A）。在S96-S0组中共鉴定出207种上调蛋白和356种下调蛋白（图3B），共563个DEP（图3A）。

图2 | S24-S0，S60-S0和S96-S0之间的重叠DEP维恩图。

每个发展阶段下调（B）和上调（C）的DEP数量显示在不同的圆圈中。

图3 | 草菇S24–S0、S60–S0 和 S96–S0 中的DEP火山图

以红色（FC ≥ 1.5）和绿色（FC ≤ 2/3）突出显示的点表示表达水平显著不同的蛋白质（p≤ 0.05）。

3. 层次聚类分析

DEP的分层聚类分析更清楚地显示了四个时间点之间蛋白质丰度的变化（图4）。S0、S24、S60和S96的颜色变化显著，表明4个时间点的蛋白表达水平变化显著。S0、S24 和 S60 组之间颜色的显著变化表明蛋白质表达的显著变化。

图4 | S24、S60和S96组与S0组草菇DEPs的聚类分析

与基线水平相比，红色、绿色和黑色分别表示蛋白质丰度增加、减少和无变化。

4.DEP 的 GO 分析

GO结果表明，细胞过程、代谢过程、单生物体过程、细胞成分组织或生物发生、生物调控、定位、对刺激的反应、生物过程的负调控、生物过程的正向调控等过程对草菇在15°C贮藏期间的老化有重要影响（图5（A-BP））。DEP 的数量随着存储时间的延长而增加。

一般而言，与0 h样品中鉴定的蛋白质相比，DEPs含量随着贮藏时间的延长而逐渐增加，参与生物过程、细胞成分和分子功能的DEPs含量逐渐增加。更具体地说，DEPs的内容分为细胞过程，代谢过程，单生物体过程，细胞成分组织或生物发生，生物调节，细胞部分，细胞器，细胞器部分，大分子复合物结合，催化活性，结构分子活性，转运蛋白活性等随着储存时间的增加而增加，在生物调节和其他过程发挥了重要作用。

图5 | 上述DEP在三个领域的GO术语的生物信息学分析

5.KEGG通路分析

对595个DEP进行了KEGG分析，以探索不同蛋白质的代谢途径和功能。结果揭示了88种不同的代谢途径，其中9种显著改变。S24–S0、S60–S0 和 S96–S0 中的 DEP 均参与 RNA 转运、α-亚麻酸代谢以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（p< 0.05）（图 6）。

此外，RNA转运途径在所有途径中富集了最多的DEP。在S60–S0和S96–S0中，DEPs参与脂肪酸降解、过氧化物酶体、赖氨酸生物合成、核糖体和赖氨酸降解的途径（p< 0.05），核糖体和过氧化物酶体途径中富集的DEPs多于其他途径。然而，只有一种蛋白质参与赖氨酸的生物合成和降解途径。因此，RNA转运、核糖体、过氧化物酶体、赖氨酸生物合成和降解途径中的相关DEP是进一步讨论的重点。

图6 | S24-S0 （A）、S60–S0 （B）和 S96–S0 （C）中前 10 条富集 KEGG 通路的气泡图

6.DEP 之间蛋白质相互作用（PPI）的分析

PPI网络（图7）显示，S60-S0（图7B）和S96-S0（图7C）组之间的KEGG途径有许多相似之处，两者都含有参与α-亚麻酸代谢的DEP;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成;核糖核酸转运;脂肪酸降解;过氧化物酶体;和核糖体途径。相比之下，S24-S0（图7A）组与S60-S0和S96-S0组显著不同。只有α-亚麻酸代谢;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成;这些群体的RNA转运途径重叠。

图7 | PPI 网络图

相关讨论

聚腺苷酸结合蛋白1（PAB1）、真核翻译起始因子3亚基A 1（RPG1）、乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）、醇脱氢酶3（ADH3）、醇脱氢酶2（ADH2）、醛脱氢酶5（ALD5）和琥珀酸脱氢酶2（SDH2）（图8）等DEPs在15 °C贮藏期间也参与了草菇老化途径。RNA从细胞核到细胞质的转移是基因表达的基础。RNA转运、核糖体和mRNA监测途径以及其他与转录相关的途径参与了15 °C贮藏期间的草菇老化。核糖体功能下降，可能导致相关基因调控降低。脂肪酸组成的变化影响了细胞膜，这可能加速草菇的成熟和衰老。

研究结论

研究运用iTRAQ标记定量蛋白质组学描述了草菇采后15 °C储存的衰老的机制。该机制可能与参与蛋白质合成和转录、脂肪酸合成和代谢以及氨基酸合成和代谢的DEPs的调节有关。此外，大多数RNA转运相关蛋白被下调，这可能导致相关基因调控的降低。其他重要蛋白质的表达，如脂肪酸代谢相关蛋白质增加;脂肪酸组成的变化影响细胞膜，可能加速伏尾弧菌子实体的成熟和感知。

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