项目文章| 蛋白质组学和代谢组学联合分析为早花百子莲胚性能力的获得提供见解

（点击图片报名千万医学支持计划）

植物细胞具有全能性，体细胞胚胎发生（SE）是通过体细胞重编程，参与细胞去分化和再分化的过程而产生体细胞胚，最终发育成新的完整的植株，SE是研究植物细胞全能性的重要模型。基于细胞全能性，胚性愈伤组织（EC）在植物快繁、种质资源保存、遗传转化、胚胎学研究等方面表现出极大优势。目前为止，EC的获取被证实是植物SE的关键过程。在这种高度精细的系统中，鉴定和剖析与胚胎发生能力获得相关的特定细胞事件至关重要。然而，通常情况下又难以利用形态学等数据来鉴定细胞的胚胎发生潜能。近年来，转录组学、蛋白质组学、代谢组学等技术的发展和应用极大地促进了植物SE机制的研究。

2022年5月，信阳农林学院园艺学院岳建华副教授课题组在Frontiers in Plant Science期刊发表了题为“Integrated Proteomic and Metabolomic Analyses Provide Insights Into Acquisition of Embryogenic Ability in Agapanthus praecox”的研究成果，通过蛋白质组学、代谢组学和转录组学研究方法，揭示了胚性愈伤组织（EC）诱导过程中重要的分子和生化信息，为全面了解体细胞胚胎发生（SE）和器官发生途径相关的植物再生机制研究提供了重要见解。

早花百子莲（Agapanthus praecox）是一种单子叶、多年生草本植物。该物种以其观赏品质而闻名，常用于切花、盆栽和花境栽培。然而其花前成熟期通常需要3-4年，种子繁殖成本昂贵、耗时，并且后代易产生性状分离。因此，有必要建立早花百子莲高效的SE再生体系。前期研究发现，从愈伤组织（CA）到EC的转变是早花百子莲SE的关键。然而，缺乏稳定、有效的EC诱导方法成为制约SE理论及应用研究的瓶颈。

该研究以早花百子莲愈伤组织细胞不同分化方向（IEC、IOC和GEC）和阶段（IEC和REC）的材料为研究对象，研究样品间的分子差异，特别是与早花百子莲胚胎发生能力获得相关的事件与通路。胚胎发生能力相关蛋白和代谢物信息的发掘，有助于针对性地改善早花百子莲EC的获取方法。

1. 研究材料及处理方法：

材料：早花百子莲

处理方法：以小花梗诱导的愈伤组织作为外植体，进行不同再生途径及阶段样品的培养。验证实验将CA放置于以蔗糖、葡萄糖和麦芽糖为碳源的培养基上进行诱导，或以蔗糖和麦芽糖为组合碳源的培养基进行培养。每个培养皿接种9个愈伤组织细胞团（约1 g），每个重复包含10个培养皿，进行3次生物重复。

2.蛋白质组学分析：3次重复

3.GC-MS代谢组学分析：6次重复

4.转录组学分析：3次重复

1、细胞分化的形态学、蛋白质组学和代谢分析概述

图1展示了不同分化方向和阶段的样本。CA呈白色、半透明状。IOC（器官发生途径的CA）外观与CA相似，不同之处在于它可以产生颗粒状不透明的芽原基(BP)。GEC相对不透明且略带黄色，表面粗糙。IEC（初次体胚发生）为小团块亮黄色细胞团，具有很高的增殖率和细胞活力。其生长速度比非EC更快，细胞分裂也更频繁，REC（重复体胚发生）则为松散的黄色细胞团块。SEC（继代培养的EC）质地易碎，表面粗糙，颜色为黄色。通过醋酸洋红染色发现CA、IOC和GEC细胞直径大，细胞质薄，而IEC、REC和SEC细胞直径小，细胞质致密。

在不含有毒莠定（PIC）的培养基上继续培养，不同分化方向和阶段相关的样品显示出不同的再生效率。由于缺乏外源生长素，CA逐渐褐化，IOC和IEC可分别诱导出不定芽和体细胞胚。在GEC的样本中诱导了极少量的体细胞胚。REC可自发再生SE，但体细胞胚诱导效率明显降低，而且大多数体细胞胚在REC中显示出异常的极性结构。SEC可诱导体细胞胚，但与IEC相比，体细胞胚数量明显减少（图1D）。样品间再生效率存在显著差异，表明IEC是早花百子莲再生的理想材料。

维恩图展示了5个比较组中共有的DAPs。其中，12个DAPs在IEC中被特异性富集，10个DAPs在IOC中被富集，65个DAPs在REC中被富集（图3A）。通过对DAPs进行层次聚类分析，确定了CA分化方向。基于蛋白质积累水平的K-means聚类方法对差异模式进行分类，共产生10个聚类，如图3B所示，IEC中富集79个DAPs(C7)。如图3C所示，IEC中49个DAPs富集较少(C2)。结果表明，C5中57个DAPs在IEC中为特异性富集，比CA显著增加（图3D）。

KEGG分析显示，这些DAPs主要参与萜类化合物和聚酮化合物的代谢、外源性生物降解和代谢、氨基酸代谢、聚糖生物合成和代谢、脂质代谢、其他氨基酸代谢、内分泌系统、辅因子和维生素代谢和碳水化合物代谢。在DAPs中，过氧化物酶（A0A5P1F2L4）、C2H2型结构域蛋白（A0A5P1FM85）和组蛋白H2B（A0A5P1FK74）在IOC和IEC中与CA相比显著富集。同时，IOC与IEC相比，BTB/POZ结构域(A0A2H9ZSK5)、过氧化物酶(A0A2I0X575)和β-D-木糖苷酶(A0A2I0V9J4)大量积累。

上述结果表明，碳水化合物和能量代谢、氨基酸代谢、次生代谢产物、染色质可及性和DNA甲基化可能在细胞分化方向中起重要作用。REC/IEC对比组DAPs主要参与外源生物降解和代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、聚糖生物合成和代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、能量代谢、复制和修复、辅因子和维生素代谢、内分泌系统和衰老。如图3H所示，碳水化合物和能量代谢、衰老和遗传信息处理在细胞分化阶段发生了显著变化。

所有代谢物富集水平的层次聚类证明了QC与其他样品之间关系的稳定性。GEC、IOC和IEC被为分一组，REC和SEC聚集在一起，CA单独一组（图4A）。390个DAMs被鉴定，主要包括糖类、糖苷类、氨基酸、有机酸和次生代谢物。以CA、IEC、IOC和GEC作为样本，通过层次聚类分析确定了细胞分化方向的代谢谱。DAMs中的1-磷酸葡萄糖、6-磷酸海藻糖、3-脱氧戊糖醇、1,6-二磷酸果糖和左旋葡聚糖在IEC和GEC中高度积累（图4E）。C8中的DAMs主要积累于IEC样本中；29个DAMs从CA到IEC显著增加。

此外，这些DAMs是专门在IEC中积累的，而不是在REC和SEC中积累的。这些DAMs富含碳水化合物代谢途径，包括D-阿拉伯糖、1-磷酸葡萄糖、D-1,6-二磷酸果糖、3-核糖、葡萄糖、麦芽糖醇和6-磷酸葡萄糖（图4D）。值得注意的是，不仅在分化方向分析中，而且在分化阶段分析中脱氢抗坏血酸在IEC中均被显著富集（图4D，E）。有趣的是，在不同方向和阶段鉴定出的大多数一些代谢物都富集在相同的途径中，例如糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、半乳糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢以及抗坏血酸和醛糖酸代谢（图4D，E）。

5.外源碳源对细胞分化的影响

通过以上分析，推测碳源可能是影响细胞分化的重要因素。通过对蔗糖、葡萄糖和麦芽糖处理转录组数据分析，分别得到了9,797、5,714和3,921个DEG（图7A）。

PCA模型显示非EC（Suc、Glu和Mal）和IEC样品可以明显被区分（22.34%），并且用蔗糖培养的CA与IEC关系更密切（图7B、C）。

KEGG分析显示当用不同碳源进行愈伤组织培养时，植物激素信号转导、糖酵解/糖异生、类黄酮生物合成以及淀粉和蔗糖代谢表现出不同的表达模式。这表明碳源可能影响EC的诱导。

用不同的碳源培养CA（图7D）结果表明，葡萄糖提升了细胞增殖效率、细胞团大小和细胞大小，而麦芽糖显著降低生长系数、细胞团大小和细胞大小。此外，麦芽糖促进器官发生，BP诱导明显（图7E-G)。与此同时，通过蔗糖处理可获得EC。

此外，不同碳源（蔗糖和麦芽糖）的比例影响细胞分化方向，其中蔗糖有利于EC诱导，麦芽糖有利于器官发生（图7H-J）。结果表明：糖代谢影响早花百子莲CA分化方向，其中外源蔗糖在胚胎发生能力的获得过程中是必不可少的，而麦芽糖有诱导器官发生的趋势。

SE是植物快繁的重要途径之一，早花百子莲的蛋白质组学和代谢组学分析发现了EC形成过程中几个与SE相关的通路。IEC、IOC和REC中特异表达的DAPs和DAMs表明，这些蛋白质和代谢物有助于早花百子莲的细胞分化。EC特异性途径之间的显著相关性表明碳水化合物和能量代谢、活性氧(ROS)响应、染色质可及性和DNA甲基化，以及植物激素信号可能起调节作用。

文章假设了早花百子莲EC诱导的模型（图8）。如图所示，CA经历了不同的分化方向，表现出不同的能量供应、ROS清除能力、激素信号转导和染色质可及性水平。所有这些差异可能是导致早花百子莲获得胚胎发生能力的原因。

研究揭示了早花百子莲EC诱导过程中发生的分子和生化变化，为全面了解早花百子莲SE和器官发生相关的机制提供了基础。通过用网络分析，研究者确定了参与细胞分化的潜在关键DAPs和DAMs。并得出结论，碳水化合物和能量代谢对于控制CA和EC之间的转换至关重要。

研究结果表明，碳水化合物和能量代谢共同激活了细胞全能性或细胞多样性，从而诱导了EC和器官。未来的研究应侧重于碳水化合物代谢、ROS响应、染色质可及性和植物激素信号之间可能的相互作用，这些可能对早花百子莲胚胎发育能力的获得具有重要影响。

END

空气|撰文

小久|排版

欢迎转发到朋友圈

本文系鹿明生物原创

转载请注明本文转自鹿明生物